qPCR檢測方法

qPCR的目的是在PCR期間監(jiān)測目標(biāo)DNA分子(DNA或cDNA)的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的實時檢測可以通過使用DNA結(jié)合染料和熒光PCR引物或探針兩種方法來實現(xiàn)。

DNA結(jié)合染料是一種非特異性的熒光染料，與任何雙鏈DNA分子(dsDNA)相互作用。這些染料的化學(xué)性質(zhì)可能很簡單，但它們非常有效。DNA與染料結(jié)合所釋放的熒光量與dsDNA的數(shù)量成正比，常用的DNA結(jié)合染料的例子是SYBR Green。

與DNA結(jié)合染料不同的是，熒光PCR引物和基于探針的化學(xué)反應(yīng)可以根據(jù)熒光淬滅的原理對目標(biāo)DNA序列進(jìn)行特異性結(jié)合。在本質(zhì)上，PCR引物或目標(biāo)特異性寡核苷酸探針被標(biāo)記報告基團(tuán)，并被淬滅基團(tuán)淬滅。一旦引物或探針與特定的目標(biāo)序列結(jié)合，報告集團(tuán)和淬滅集團(tuán)被一個特定化學(xué)的機(jī)制分開(裂開或因距離分開)，產(chǎn)生熒光。所釋放的熒光量與樣品中特定的目標(biāo)DNA數(shù)量成正比。

qPCR產(chǎn)物檢測考慮事項:

1、特異性

DNA結(jié)合染料的優(yōu)點之一是它們理論上可以與任何一種dsDNA分子進(jìn)行插入，提供一個強(qiáng)大的信號讀出。然而，由于這種非特異性，如果你的PCR擴(kuò)增出了錯誤的目標(biāo)，或者超過一個目標(biāo)，或者形成引物二聚體分子，DNA結(jié)合染料會結(jié)合并報告這些dsDNA分子。這會給你一個假陽性信號。可以通過在qPCR實驗后進(jìn)行熔融曲線或離解曲線來監(jiān)測。一般來說，如果不太關(guān)注目標(biāo)的特異性，并且試圖表現(xiàn)出許多基因的快速表達(dá)，或者正在檢查你的PCR引物的特異性，那么DNA結(jié)合染料是一個理想的選擇。 

相比之下，熒光PCR引物和基于探針的化學(xué)反應(yīng)是高度特異性的，這使得輸出數(shù)據(jù)更加方便。如果想要真正放大你的目標(biāo)序列，它們是理想的。對于在很長一段時間都集中在同一組基因的研究人員，這往往是一個很受歡迎的選擇。

2、成本

在計劃任何實驗時，成本都應(yīng)該考慮在內(nèi)。DNA結(jié)合染料只需要購買引物(很像傳統(tǒng)的PCR)，相對便宜。熒光化學(xué)實驗所需要的特異性探針和引物使這些方法昂貴得多,不過，如果你只有幾個目標(biāo)，那可能是較好的選擇。

3、目標(biāo)的豐度

當(dāng)你的目標(biāo)是很少或弱表達(dá)時，引物通常會形成二聚體結(jié)合到到錯誤的目標(biāo)。在這種情況下，你應(yīng)該使用基于熒光的化學(xué)反應(yīng)。如果你的興趣目標(biāo)更豐富，可以研究使用DNA結(jié)合染料的可能性。

qPCR探針的選擇

當(dāng)涉及到熒光PCR引物和基于探針的化學(xué)反應(yīng)時，有很多選擇。這取決于你可以使用哪種PCR儀器。不同的探針會以不同的波長發(fā)出熒光，并不是所有的儀器都會探測到所有的探針。

1 .成本

考慮降低成本的情況，水解探針和蝎子探針是很好的選擇。與目前市面上所有的熒光化學(xué)物質(zhì)相比，水解探針是目前市場上不僅可靠，而且更便宜的一種，如TaqMan。由于引物的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，蝎子系統(tǒng)不需要開發(fā)和購買單獨的探頭，使它們成為一個方便且具成本效益的選擇。

2．時間

考慮時間的情況，蝎子探針可能是一個解決方案。不僅引物和探針存在于一個莖環(huán)分子上，而且可以在快速循環(huán)條件下工作。水解探針也可能是理想的，因為它們非常可靠的，故障排除小。這些往往被廣泛用于高通量擴(kuò)增分析。

3 .特異性:

如果你的目標(biāo)很少，這將是一個非常重要的問題，可以考慮分子信標(biāo)探針和雙雜交探針。當(dāng)結(jié)合到目標(biāo)時，由一個分子信標(biāo)探針發(fā)射的熒光量通常比在自由溶液中釋放的光量大100倍。雙雜交的化學(xué)性質(zhì)是有兩個探針，促進(jìn)更高的特異性。

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