Western blot實(shí)驗(yàn)中常常出現(xiàn)各種問題？基爾頓生物為您解答以下幾點(diǎn)主要困惑：

1、蛋白質(zhì)電泳時(shí)配制的凝膠為什么凝固前是有毒的，凝固后就無毒性了呢？

因?yàn)榘l(fā)發(fā)生了聚合反應(yīng)，丙烯酰胺是單體，甲叉雙丙烯酰胺是交聯(lián)劑，在水溶液中，單體和交聯(lián)劑通過自由基印發(fā)的聚合反應(yīng)形成凝膠。

2、內(nèi)參怎么做？是在同一張膜上還是另外再跑一張膜來做？是不是與蛋白的分子量大小有關(guān)系呢？

可以用同一張膜，轉(zhuǎn)膜后先用目的蛋白的抗體做雜交，將抗體洗掉，再用內(nèi)參抗體重新雜交，結(jié)果顯示信號(hào)一致，就可以認(rèn)為上樣量一致。

3、WB電泳出現(xiàn)笑臉和哭臉的情況？

出現(xiàn)笑臉是因?yàn)楣嗄z的時(shí)候冷卻不均勻，中間部分沒冷卻好，導(dǎo)致凝膠中的分子有不同的遷移率所致。

4、做western，背景很深，目的蛋白恨模糊，actin很清楚，什么原因？

背景比較重，可能是二抗?jié)舛雀吡嘶蛘叨瓜吹貌粡氐?；如果是單純的目的條帶弱，有可能蛋白表達(dá)量本身就低，或者一抗?jié)舛炔粔颉?/span>

5、麗春紅染膜能看到清晰的條帶，但是發(fā)光的片子上去沒有條帶？

麗春紅染膜能看到條帶，只能說明轉(zhuǎn)膜是沒有問題的，所以沒有條帶應(yīng)該是磚模后的步驟有問題?？膳挪楹筮叺牟襟E。

6、轉(zhuǎn)膜的時(shí)候蛋白marker是不是可轉(zhuǎn)可不轉(zhuǎn)，不轉(zhuǎn)對(duì)后邊實(shí)驗(yàn)是否有很大的影響？

這種方法在樣本多的情況下很容易弄混，這么做主要是后期孵抗體的時(shí)候可以將膜封閉到很小的空間里進(jìn)行孵育，可以節(jié)省抗體。

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