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- 產(chǎn)品名稱：無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒
- 產(chǎn)品型號：PD1520-01
- 產(chǎn)品展商：Biomiga
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- 產(chǎn)品文檔：無相關(guān)文檔
- 發(fā)布時間：2018-07-31
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簡單介紹
無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒（EndoFree plasmid ezFlow maxi kit）處理100-200mL的菌液，可獲得500-1000μg的質(zhì)粒DNA。
產(chǎn)品描述
無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒（EndoFree plasmid ezFlow maxi kit）處理100-200mL的菌液，可獲得500-1000µg的質(zhì)粒DNA。
無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒組分：
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Catalog #
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PD1520-00
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PD1520-01
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PD1520-02
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Preps
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2
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10
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25
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ezBindTM Columns
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2
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10
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25
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Buffer A1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer B1
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer N3
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8 mL
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40 mL
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85 mL
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Buffer KB
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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Buffer RET
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22 mL
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110 mL
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270 mL
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RNase A(20 mg/mL)
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2.2 mg
(110μL)
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11 mg
(550μL)
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27 mg
(1.35mL)
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Endofree Elution Buffer
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5 mL
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25 mL
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60 mL
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User Manual
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1
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1
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1
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實驗前準(zhǔn)備：
1、RNase A：室溫下可穩(wěn)定保存半年，使用前將提供的所有RNase A瞬時離心后加入Buffer A1, 使用后將Buffer A1/RNase A置于4oC保存。
2、Buffer B1：在低于室溫時會沉淀，請于50oC左右水浴加熱至沉淀完全溶解，溶液澄清，使用后保證Buffer B1瓶蓋旋緊。
3、準(zhǔn)備70%和100%的乙醇。
4、在室溫下（22-25℃）進(jìn)行所有離心操作。
注意事項：
1、質(zhì)?？截悢?shù)：純化中低拷貝的質(zhì)粒時，使用2倍的菌液體積，2倍的Buffer A1,B1,N3,100%乙醇，相同體積的70% 乙醇和Endofree Elution Buffer。
2、轉(zhuǎn)化菌：若為-70℃甘油凍存的菌，請先涂布平板培養(yǎng)后，再重新挑選新的單個菌落進(jìn)行培養(yǎng)。注意：切勿直接取凍存在4oC的菌進(jìn)行培養(yǎng)。
3、柱結(jié)合能力：1mg
4、對富含內(nèi)源核酸酶的宿主菌（endA＋）如HB101, JM101, TG1等，需去核酸酶，請使用產(chǎn)品PD1713。
無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒操作簡明步驟：
1、取100 µL新鮮的菌液接種到150-200 mL (勿超過 200 mL)的LB培養(yǎng)基（含適量***），37oC震蕩培養(yǎng)14-16小時。室溫下5,000 x g離心10分鐘，收集菌體，并盡可能的吸去上清。注：殘留的液體培養(yǎng)基容易導(dǎo)致菌液裂解不充分，離心后沉淀較松，不能有效吸取上清。注：本說明書中的操作程序適用于標(biāo)準(zhǔn)LB （Luria Bertani）培養(yǎng)基培養(yǎng)12-16 小時后，OD600（**密度）在2.0-3.0之間的菌液。若采用的是富集培養(yǎng)基，例如TB 或2×YT，請注意保證OD600不超過3.0。
2、加入10 mL Buffer A1（確保已加入RNase A），用移液器或渦流震蕩確保**沉淀重新懸浮。 注：不完全懸浮易導(dǎo)致菌體裂解不完全，從而使產(chǎn)量降低。
3、加入 10 mL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻，然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。 注：切勿劇烈振蕩。靜置時間不應(yīng)超過5分鐘，時間過長會導(dǎo)致基因組DNA污染或質(zhì)粒受到破壞。若溶液未清亮澄清，則表明菌體裂解不充分，應(yīng)加大Buffer B1的用量或減少菌體量。
4、加入3 mL Buffer N3, 立即反轉(zhuǎn)5次，用手用力搖晃3-5次充分混勻，此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5、將離心管轉(zhuǎn)至高速離心機(jī)，在室溫下12,000 x g離心10分鐘（若上清中有白色沉淀，可再次離心）。注：低溫下RNase不工作，易有RNA污染。如果離心機(jī)轉(zhuǎn)子較冷，將離心管在室溫下溫育10分鐘后再離心。若無告速離心機(jī)，可用Syringe filter替代(在PD1522中提供，也可單獨購買)。
6、轉(zhuǎn)移上清液20 mL（不超過20 mL）至新的50mL離心管中，加入0.5倍體積的Buffer RET (即每20 mL裂解液加入10 mL Buffer RET) 及10 mL的100% ethonal，用手用力甩5次以混勻，需馬上離心過DNA柱。
7、立即轉(zhuǎn)移20 mL裂解液/收集管至帶收集管的DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。將剩余溶液轉(zhuǎn)移至DNA柱中，室溫下> 2,500 x g離心2分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)直至所有的溶液通過DNA柱。注：如果50 mL的收集管與離心機(jī)轉(zhuǎn)子不符，可在臺式離心機(jī)> 2,500 x g 離心2分鐘。
8、向離心柱中加入10 mL 70% 乙醇，室溫下> 2,500 x g離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“9”。
9、將離心柱放回高速離心機(jī)中，室溫下5,000 x g開蓋離心10分鐘，以徹底去除殘留的乙醇。注：此步驟中開蓋離心將會更有效的去除殘留的乙醇，乙醇是否去除干凈將會影響*后的洗脫效率。若轉(zhuǎn)速低于5,000 x g，需離心20分鐘，并可放在空氣中晾干。
10、將離心柱轉(zhuǎn)至一個新的50 mL離心管中，向DNA柱膜的正中加入1-1.5 mL 的Endofree Elution Buffer，室溫放置1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘，以洗脫質(zhì)粒DNA。將50 mL離心管中的洗脫液上柱再放置洗脫1分鐘，> 2,500 x g離心5分鐘。兩次洗脫將提高得率。注：提取到的質(zhì)粒DNA可用于轉(zhuǎn)染內(nèi)**敏感性細(xì)胞株，原代細(xì)胞及用于微注射，建議去除內(nèi)**。
無內(nèi)**快速質(zhì)粒大量提取試劑盒操作流程：
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