注意事項(xiàng):
1、使用前請將適量乙醇加入DNA Wash Buffer,令乙醇終濃度為80%;
2、純化中低拷貝的質(zhì)粒時,使用2倍的菌液體積,2倍的Buffer A1,B1,N1, 相同體積的Wash Buffer和Elution Buffer;
3、若為-70oC甘油凍存的菌,請先涂布平板培養(yǎng)后,再重新挑選新的單個菌落進(jìn)行培養(yǎng)。
質(zhì)粒小量提取試劑盒操作簡要步驟:
1、接種新鮮的單個菌落到1-4 mL的LB培養(yǎng)基(含適量***),37oC震蕩培養(yǎng)14-16小時。室溫下10,000 x g離心1分鐘,收集菌體,并盡可能的吸去上清。
2、 加入250 µL Buffer A1(確保已加入RNase A),用移液槍或渦流震蕩充分懸浮**細(xì)胞。
3、加入 250 µL Buffer B1, 輕輕地反轉(zhuǎn)5-10 次以混合均勻,然后靜置2-5分鐘至溶液粘稠而澄清。
4、加入350 µL Buffer N1, 立即反轉(zhuǎn)多次,至溶液充分混勻,此時出現(xiàn)白色絮狀沉淀。
5、室溫下13,000 rpm離心10分鐘(若上清中有白色沉淀,可再次離心)。
6、小心吸取離心后的上清液至帶有收集管的DNA柱中(避免吸起沉淀),室溫下13,000 rpm離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。
7、可選: 向DNA柱中加入 500 µL Buffer KB, 室溫下13,000 rpm 離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。
8、向離心柱中加入650 µL DNA Wash Buffer(確保已加入無水乙醇),室溫下,13,000 rpm 離心1分鐘,倒掉收集管中的廢液,將離心柱重新放回到收集管中。重復(fù)步驟“8”。
9、將離心柱放回高速離心機(jī)中,13,000 rpm室溫下開蓋離心2分鐘,以徹底去除殘留的乙醇。
10、將離心柱轉(zhuǎn)至一個新的1.5 mL離心管中,向DNA柱的正中間加入50~100 µL(體積>50 µL)的ddH2O(pH在7.0-8.5之間)或Elution Buffer,室溫放置2分鐘,13,000 rpm 離心1分鐘,洗脫質(zhì)粒DNA。將洗脫液再加入到柱中,在13,000 rpm 離心1分鐘,收集洗脫液。
質(zhì)粒小量提取試劑盒操作流程: