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中文名稱
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2× SYBR Green qPCR 試劑盒
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英文名稱
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2× SYBR Green qPCR Mix
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Cat #
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021-200次x 50μL反應(yīng)體系
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規(guī)格
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200次x 50μL反應(yīng)體系
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貯存條件
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-20°C干燥避光保存
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Ex (nm)
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497
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Em (nm)
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525
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保質(zhì)期
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6個(gè)月
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狀態(tài)
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現(xiàn)貨
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2× SYBR Green qPCR Mix
包裝量：
產(chǎn)品組成、儲(chǔ)存、濃度：
儲(chǔ)存：-20 ℃ 避光保存6個(gè)月，使用前充分溶解混勻。短期使用可放在4 ℃，避免反復(fù)凍融。
制品說明：
本制品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進(jìn)行Real Time PCR的專用試劑。已經(jīng)將熱啟動(dòng)HotMaster Taq DNA聚合酶、dNTP、特殊穩(wěn)定劑、優(yōu)化的反應(yīng)緩沖液、BSA和SYBR Green I等試劑預(yù)混成一種適合Real Time PCR反應(yīng)檢測用2×Premix Type試劑，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等特點(diǎn)。使用時(shí)只需加入模板、引物和水，便可在寬廣的定量區(qū)域內(nèi)得到良好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)目的基因進(jìn)行準(zhǔn)確定量檢測，重復(fù)性好，可信度高。
本品采用全新的Hotmaster Taq DNA 聚合酶，該酶不同于一般Hot-start 酶之處在于，一般的Hot-start 酶只在**步溫度升高之前封閉酶的活性，而Hotmaster Taq DNA 聚合酶是利用抑制劑通過溫度調(diào)節(jié)方式封閉Hotmaster Taq DNA聚合酶的底物結(jié)合位點(diǎn)，溫度低于40℃時(shí)，形成非活性的酶-抑制劑復(fù)合物，當(dāng)溫度升高至引物特異性的退??溫度時(shí)，結(jié)合平衡向模板-特異性引物復(fù)合物形成方向移動(dòng)，因此*大限度的減少PCR擴(kuò)增全程中的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生，大大提高了熒光定量PCR反應(yīng)的**性。
注意事項(xiàng)：
1. 本制品不含參比染料ROX，客戶可根據(jù)qPCR儀器技術(shù)指導(dǎo)決定是否需要加ROX參比染料，用于消除信號(hào)本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號(hào)誤差。
2. 本制品含SYBR Green I 強(qiáng)光下易分解，降低靈敏度，使用時(shí)避免長時(shí)間強(qiáng)光照射本制品。
3. 建議在冰上配制PCR反應(yīng)液，再放入PCR儀器中擴(kuò)增?？梢蕴岣邤U(kuò)增特異性，減少背景。
4. 本制品含有4 mM MgCl2(反應(yīng)體系終濃度是2 mM Mg2+)，可用25mM MgCl2 優(yōu)化Mg2+濃度。
建議PCR條件(以50 μL 反應(yīng)體系為例，反應(yīng)液配制請(qǐng)?jiān)诒线M(jìn)行)
PCR 循環(huán)(三步法)
熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)常見問題和解決方案
A1: 無信號(hào)值出現(xiàn)
Q1：
1. 反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般都要在35個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)(如至45cycles)，但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過多的背景信號(hào)。
2. 檢測熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。
3. 引物或探針降解?？赏ㄟ^PAGE電泳檢測其完整性。
4. 引物或探針的設(shè)計(jì)，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸的情況。
5. 模板量不足。對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的*高濃度做起。
6. 模板降解。避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。
A2: CT值出現(xiàn)過晚
Q2：
1. 擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針;用三步法進(jìn)行反應(yīng);適當(dāng)降低退火溫度;增加鎂離子濃度等。
2. PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。
3. PCR產(chǎn)物太長。一般采用80-150bp的產(chǎn)物長度。
A3: 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系不佳
Q3：
1. 加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。
2. 標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。
3. 引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針。
4. 模板中存在抑制物，或模板濃度過高。
典型擴(kuò)增曲線和融鏈曲線圖
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