1. 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

菁染料是性能優(yōu)良的熒光標(biāo)記染料，摩爾吸光系數(shù)在熒光染料中是*高的，其琥珀酰亞胺酯是*常

用的脂肪氨基標(biāo)記試劑，廣泛用于蛋白、抗體、核酸及其他生物分子的標(biāo)記和檢測(cè)。通過改變次甲基鏈的

長(zhǎng)度, 可改變其熒光發(fā)射波長(zhǎng)，每增加一個(gè)雙鍵，按照Huoffman 規(guī)則正好紅移約100nm。

菁染料Cy3 和Cy5 已成為基因芯片的優(yōu)選熒光標(biāo)記物; 另外,Cy5, Cy5.5 和Cy7 的吸收在近紅外區(qū)

背景非常低，是熒光強(qiáng)度*高、*穩(wěn)定的長(zhǎng)波長(zhǎng)染料。特別適合于活體小動(dòng)物體內(nèi)成像代替放射性元素。

但由于菁染料, 尤其是不對(duì)稱菁染料的合成副反應(yīng)多, 副產(chǎn)物極性相近, 產(chǎn)物的分離提純相當(dāng)困難。菁染料

特別是水溶性菁染料分子極性大, 分離提純?cè)郊永щy。

2. 菁染料琥珀酰亞胺酯(CyDye NHS)的標(biāo)記

菁染料和生物分子的比例F/P=4～12之間熒光強(qiáng)度*高， F/P值過高熒光探針會(huì)自我淬滅并影響生物

分子的生物活性，標(biāo)記生物分子*好是用單琥珀酰亞胺酯，但是用雙修飾的CyDye NHS并沒有發(fā)現(xiàn)交聯(lián)。

CyDye NHS標(biāo)記抗體在pH (8.5～9.4)時(shí)10分鐘F/P可達(dá)5～6，而在pH 7.0幾乎不反應(yīng)。我們用不同比例

的Cy3標(biāo)記anti-glutathione-S-transferase (GST)多克隆抗體發(fā)現(xiàn)用1:1, 5:1, 10:1 和 20:1標(biāo)記時(shí)得到的

F/P值分別是 0.28:1, 1.16:1, 2.3:1 和4.6:1。

3. 操作步驟

3.1 水溶性Cy3 NHS標(biāo)記anti-GST多克隆抗體

市場(chǎng)上買到的抗體如果含有其它蛋白(例如serum albumin或gelatin等)或帶氨基的緩沖液會(huì)影響標(biāo)

記，在標(biāo)記前需純化。

1. 在1 L 0.15 M NaCl 溶液中透析anti-GST抗體(濃度為 0.5 mL at 3 mg/mL)，常溫透析4小時(shí)。

2. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再透析過夜。

3. **天用1 L 0.1 M NaHCO3 (pH 8.3)透析4小時(shí)。

4. 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

5. 用0.1 M NaHCO3 稀釋少量的抗體，在280nm處測(cè)其紫外吸收值計(jì)算標(biāo)記抗體的總量 (IgG antibody

摩爾吸光系數(shù)170 000 M^-1 cm^-1 at 280 nm).

6. 用DMSO配置Cy3 NHS (MW 765.95) 溶液濃度為10 mg/mL; 計(jì)算所需體積以得到想要的CyDye

NHS 和抗體的比值(例如20:1)，然后慢慢將其加入到抗體溶液中，同時(shí)在暗處常溫緩慢攪拌45分鐘。

7. 用1 L 0.15 M NaCl 溶液常溫避光透析4小時(shí)除去未標(biāo)記上的Cy3。

8. 在4°C用新鮮的1 L 0.15 M NaCl 溶液再避光透析過夜。

9. 用1 L of 0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液常溫避光透析4小時(shí), 在4°C常溫避光再次透析過夜。

10. 用0.22 μm注射器過濾頭過濾抗體溶液。

11. 用0.01 M PBS/0.01 % 疊氮化鈉整數(shù)倍稀釋標(biāo)記抗體溶液，測(cè)量280nm(蛋白)和552nm(Cy)處

的紫外可見吸光度。

12. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在0.01 M PBS/ 0.01% 疊氮化鈉溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存。

F/P計(jì)算：

Cy3在552nm摩爾吸光系數(shù)為150 000 M^-1 cm^-1;此蛋白在280nm的摩爾吸光系數(shù)為170 000 M^-1 cm^-1;

不同蛋白的摩爾吸光系數(shù)不一樣;.Cy3 染料本身在280 nm 的吸收是552nm處的8%。按以下公式計(jì)算F/P

值。

[Cy3] = A₅₅₂/150000

[antibody] = {A₂₈₀ - (0.08×A₅₅₂)}/170000

F/P final= [Cy3]/[antibody]= {1.13×A₅₅₂}/ {A₂₈₀ - (0.08×A₅₅₂)}

3.2 水溶性Cy5 NHS標(biāo)記 (D-ser²)-leucineenkephalin

1. Cy5 NHS 1.0 mg 溶解于400 μL DMSO后，加入到1mL 的玻璃瓶中盛有(D-ser²)-leucine-enkephalin

acetate (YSGFLT, 0.75 mg) 的400 μL DMSO溶液。(Dye 和peptide 投料比是 1:1)

2. 然后加入15 μL三乙胺，常溫避光攪拌反應(yīng)混合物過夜。

3. 用HPLC 純化蛋白，使用蛋白C18柱子(25 cm×10 mm)，每次上樣注入2×400 μL，30分鐘梯度洗脫

從0.1% TFA水溶液到MeCN∶H2O(0.1% TFA)=70∶30，流速4mL /min。(對(duì)不同的蛋白選擇不

同的合適HPLC梯度流動(dòng)相)

4. 收集適當(dāng)?shù)纳珟Х?，?biāo)記多肽的保留時(shí)間比未標(biāo)記的多肽長(zhǎng)。

5. 產(chǎn)品冷凍干燥成粉末或在水溶液中，-20℃避光儲(chǔ)存;必要時(shí)可用質(zhì)譜表征。

6.CyDye標(biāo)記的蛋白穩(wěn)定性取決于蛋白本身。例如標(biāo)記的IgG在4 ℃可避光保存2月;更長(zhǎng)期的保存需加

入等體積的甘油-20 ℃避光保存。

F/P計(jì)算：

Cy5 在650 nm 的摩爾吸光系數(shù)為250 000 M^-1 cm^-1 ，所用蛋白在280 nm處的摩爾吸光系數(shù)為 170

000 M^-1 cm^-1;Cy5在280nm處的吸收是650nm處的5%。按以下公式計(jì)算F/P值。

[Cy5 dye] = (A₆₅₀)/250 000

[peptide] =[A₂₈₀ -(0.05×A₆₅₀)]/170 000

F/P final= [dye]/[peptide]= {0.68×A₆₅₀}/ {A₂₈₀ - (0.05×A₆₅₀)}

3.3水溶性 CyDye SE標(biāo)記OLIGO

氨基封端的OLIGO可以標(biāo)記CyDye SE，但是非常困難;標(biāo)記前因?yàn)镺ILGO經(jīng)氨水脫保護(hù)，請(qǐng)務(wù)必洗

滌掉所有的殘余氨水。然后將樣品真空干燥;然后溶于0.25 ml 的0.5 M NaCl 溶液中，用Sephadex G-50

脫鹽，用5.0 mM borate 緩沖液平衡到pH=8.0，然后用以上硼酸緩沖液沖下OLIGO。然后濃縮至干的樣

品溶于0.1 M carbonate buffer (pH 8.5-9.0);在0.5mL碳酸緩沖液中30 nmoles的OLIGO加入到CyDye SE

的玻璃瓶中室溫避光，密閉攪拌反應(yīng)60min。反應(yīng)物經(jīng)Sephadex G-50或 RP-HPLC過柱純化，冷凍干燥

后避光保存。

注意：Oligonucleotides 和oligopeptides由于太小經(jīng)常會(huì)留在過濾膜上或在凍存管內(nèi)貼壁

成膜，而無法標(biāo)記。

3.4活體成像領(lǐng)域

SPF級(jí) BALB/C裸鼠，6～8 周齡, 18～20克, 實(shí)驗(yàn)前24 h 自由進(jìn)食、飲水。

于實(shí)驗(yàn)裸鼠腹腔內(nèi)注射2%****鈉300μL(215 mg/ kg)麻醉動(dòng)物。將裸鼠俯臥位平放于小動(dòng)物多光

譜活體成像系統(tǒng)的記錄暗箱中。實(shí)驗(yàn)時(shí)將Cy7 或Cy7 標(biāo)記的生物分子或**DMSO 稀釋后,于裸鼠尾靜脈

注射200μL( 0.5 mg/g) [*佳用量和時(shí)間需要客戶根據(jù)自己的儀器和**試劑等條件優(yōu)化] ,每5min 記錄1

張動(dòng)物在體內(nèi)發(fā)射熒光的成像圖片,分析熒光**的分布情況。對(duì)照鼠不注射**，進(jìn)行同時(shí)記錄。記錄結(jié)

束后迅速解剖裸鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，進(jìn)行成像。

Cy7 檢測(cè)時(shí)激發(fā)波長(zhǎng)700～770 nm 帶通 ,發(fā)射波長(zhǎng)790 nm 長(zhǎng)通。液晶可調(diào)諧濾光片掃描范圍 780～

950 nm ,掃描步進(jìn)10 nm。曝光時(shí)間為500 ms。

不同的**代謝時(shí)間不一樣，注射入裸鼠體內(nèi)，熒光立即分布全身，然后逐步向膀胱聚集，呈現(xiàn)顯著

的腎排泄的特點(diǎn)一般4~6 小時(shí)，快得只有30 分鐘;如果是骨骼等部位靶點(diǎn)的Cy7 標(biāo)記**，有客戶反映

一周后活體成像系統(tǒng)仍能檢測(cè)到熒光成像。

器官切片觀察：將解剖的器官迅速放置于4%多聚甲醛固定4 小時(shí)以上，0%，20%，30%PBS 蔗糖

依次沉底，20μm 切片，多聚賴氨酸洗過的載玻片貼片，晾干，DAPI 染色。共聚焦顯微鏡觀察，激光器為

氦氖 633 nm。

穩(wěn)定性與儲(chǔ)存：

未開封的粉末在避光干燥-20℃存放12月。CyDye NHS水溶液現(xiàn)配現(xiàn)用不能儲(chǔ)存。任何溶解后的CyDye

NHS粉末*好立即使用；無水的DMSO溶液-20°C保存*多2個(gè)星期。

如需索取CY系列熒光染料 Cy5-N-羥基琥珀酰亞胺酯Cy5,SE 染液的產(chǎn)品說明書，請(qǐng)聯(lián)系公司銷售人員。


同系列產(chǎn)品有：活體成像用試劑，水溶型熒光試劑，Cy3，Cy3-N-羥基琥珀酰亞胺酯，Cy5，Cy5-N-羥基琥珀酰亞胺酯，  Cy5.5，Cy5.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯，Cy7， Cy7-N-羥基琥珀酰亞胺酯，Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488）， Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488）琥珀酰亞胺酯，Super Fluor 555（效果同Alexa Fluor 555），Super Fluor 555（效果同Alexa Fluor 555）琥珀酰亞胺酯，Super Fluor 647（效果同Alexa Fluor 647），Super Fluor 647（效果同Alexa Fluor 647）琥珀酰亞胺酯，Super Fluor 680（效果同Alexa Fluor 680），Super Fluor 680（效果同Alexa Fluor 680）琥珀酰亞胺酯，Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750），Super Fluor 750（效果同Alexa Fluor 750）琥珀酰亞胺酯，DiR碘化物，ROX參比染料，強(qiáng)力EB去毒劑，DuRed染液，D-蟲熒光素鈉鹽，熒光試劑，螢火蟲熒光素酶底物， Cy5-N-羥基琥珀酰亞胺酯Cy5,SE。

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