熒光原位雜交技術(shù)（FISH）常見問(wèn)答
對(duì)于FISH操作來(lái)說(shuō)，那些因素比較重要？
在FISH中*重要的因素是溫度、光照、濕度和各種試劑的PH值。溫度和濕度直接影響著探針和目標(biāo)DNA的雜交效率；光照影響了熒光染料的強(qiáng)度；各種試劑pH是否符合要求直接關(guān)系到FISH的穩(wěn)定性。
在夏季成功檢測(cè)的同一探針和樣本為什么在冬季就得不到理想的效果？
發(fā)生上述現(xiàn)象*大的可能是FISH操作的環(huán)境溫度發(fā)生了變化導(dǎo)致的。在我國(guó)，冬季普遍比夏季寒冷，低的環(huán)境溫度使FISH得不到良好的雜交效率。此外，探針的保存不當(dāng)也容易引起熒光素的萃滅而導(dǎo)致效果不佳。因此保證FISH操作中的溫度非常重要。
該如何保證FISH操作中的溫度？
*佳的措施是使用一些FISH的專用儀器進(jìn)行操作，諸如Vysis的Hybrit FISH雜交儀。如果是手工操作，首先要對(duì)FISH操作過(guò)程中可能使用的一些儀器進(jìn)行溫控能力的檢查，諸如水浴鍋、孵箱，對(duì)其中不符合要求的要進(jìn)行更換（**診斷中的探針要求溫控精度在1度以內(nèi)）。其次，要盡可能地保持操作環(huán)境溫度在20度以上，對(duì)于在冬季進(jìn)行的FISH操作尤為重要。此外對(duì)于需要預(yù)熱以達(dá)到要求溫度的試劑，在使用前必須使用溫度計(jì)對(duì)其進(jìn)行測(cè)溫。同時(shí)檢測(cè)的樣本*好不能超過(guò)4塊。操作中的行動(dòng)一定要迅速。操作者還往往忽視一些小部件的溫度，諸如載玻片和蓋玻片。特別是在冬季，蓋玻片本身溫度就低，加之探針的量本就不多（10ul），因此事先沒(méi)有預(yù)熱的蓋玻片會(huì)使得雜交液的溫度急劇下降嚴(yán)重地影響了探針和目標(biāo)DNA的雜交效率。因此對(duì)上述小部件的預(yù)熱也能有效地提高FISH的雜交效果。
使用熒光顯微鏡觀察結(jié)果時(shí)，*初有清晰而明亮的信號(hào)。但隨后信號(hào)急劇衰減。幾分鐘后信號(hào)就消失了。這是探針本身的質(zhì)量問(wèn)題嗎？
在正常情況下，目前的商業(yè)化探針即使是雜交后，如果保存適當(dāng)，熒光信號(hào)能保持半年以上。出現(xiàn)上述情況主要的原因是操作觀察的過(guò)程中或是探針的保存過(guò)程中沒(méi)有采取嚴(yán)格的避光措施。陽(yáng)光或是強(qiáng)的燈光都會(huì)使熒光染料發(fā)生急劇的淬滅，從而造成了觀察結(jié)果的不穩(wěn)定。因此在操作和觀察時(shí)，盡可能在暗室中操作。也可以在封片觀察時(shí)加入一定的antifade（抗淬滅劑）以延緩熒光素的淬滅。
如何配制各種試劑呢？
強(qiáng)烈建議使用去離子水配制各種所需的試劑。此外，配制后使用pH計(jì)檢測(cè)是否符合要求。配制的各種試劑都要采用超純級(jí)的要求。每次FISH使用新的試劑，舊的試劑*好棄置不用。洗脫液和變性液當(dāng)天用當(dāng)天配。
直標(biāo)型探針和間標(biāo)型探針有何不同？為什么我們要選擇直標(biāo)型探針？
所謂的直標(biāo)型探針是指DNA探針共價(jià)連接著熒光素基團(tuán)；間標(biāo)型探針則是指DNA探針先與某個(gè)半抗原連接，諸如生物素或地高辛，然后半抗原與熒光素基團(tuán)連接從而形成探針－半抗原－熒光素基團(tuán)，類似“三明治”的復(fù)合物。與間標(biāo)型探針相比，直標(biāo)型探針具有低背景、高特異性的特點(diǎn)。隨著熒光染料和熒光檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，直標(biāo)型探針的靈敏度也不斷提高。因而在FISH檢測(cè)領(lǐng)域，尤其是在**分型領(lǐng)域，探針大多采用直標(biāo)型設(shè)計(jì)。
能對(duì)同一樣本進(jìn)行多次的FISH操作嗎？
在多數(shù)情況下，如果FISH操作沒(méi)有得到正常的結(jié)果，我們可以將探針洗去，然后使用同樣的探針進(jìn)行再次的雜交。如果我們使用的是直標(biāo)型探針，還可以使用不同探針對(duì)同一樣本進(jìn)行反復(fù)雜交。針對(duì)不同的樣本，處理方法略有不同。
外周血樣本的處理：
1、使用鑷子小心地揭去雜交區(qū)的蓋玻片
2、將樣本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分鐘以便充分地脫水。將片子風(fēng)干后就可以進(jìn)行重復(fù)的雜交了。二次雜交中建議將變性的時(shí)間縮短一半，但不得少于3分鐘。如果對(duì)同一樣本還要進(jìn)行三次雜交，變性的時(shí)間就無(wú)需減少了。
對(duì)于多次雜交，復(fù)染液濃度的降低有利于保持探針的亮度。曾有報(bào)道在同一樣本片上進(jìn)行了多達(dá)8次的FISH操作。
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