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ELISPOT操作過程
ELISPOT操作過程
1. 用50ul 70%酒精孵育PVDF孔板，室溫下孵育1分鐘。
2. 倒去酒精，用100ul PBS洗滌3次。
3.將100ul捕獲抗體加入10ml PBS中，混合， 每孔加100ul， 蓋上板蓋，4℃過夜。
4.倒去液體，100ul PBS洗滌一次。
5.每孔加入100ul 2%脫脂乳PBS（見試劑準(zhǔn)備），蓋上板蓋，室溫下孵育2小時。
6.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
7.用100ul PBS洗滌一次。
8.每孔加入100ul細(xì)胞懸浮液（含適當(dāng)量的細(xì)胞和相應(yīng)濃度的刺激劑）。細(xì)胞可預(yù)先在體外接受刺激（間接ELISPOT）。蓋上標(biāo)準(zhǔn)的96孔板塑料板蓋，37℃ CO2孵育箱中孵育一定的時間（15-20小時）。這期間不要晃動或移動孔板。
9.在水槽邊和吸水紙上輕打，倒去液體。
10.ELISPOT每孔加100ul洗滌緩沖液，4℃孵育10分鐘。
11.用100ul洗滌緩沖液洗孔3次。
12.于10ml PBS-1%BSA中稀釋100ul檢測抗體，此為一板的量。每孔加100ul此液體，蓋上板蓋，室溫下孵育2小時 。
13.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。
14.每板以10ml PBS-1%BSA稀釋10ul的親和素堿性磷酸酶。每孔加入100ul此液體，蓋上板蓋，室溫下孵育1小時。
15.倒去液體，用100ul洗滌緩沖液洗3次。在吸水紙上拍打，吸干殘留的洗滌液。
16.每孔加入100ul BCIP/NBT。
17.室溫下反應(yīng)5-15分鐘。完全顯色后，將此液倒于相應(yīng)的盤中。
18.用蒸餾水充分洗滌膜的兩邊。吸水紙上輕拍，使膜干燥。保存時，將板倒置以免殘留的液體流回膜上一旦膜干燥后，讀取點(diǎn)數(shù)。4℃下放置一夜，點(diǎn)會比較明顯。
此板在室溫下避光保存。
使用時應(yīng)注意BCIP/NBT緩沖液是潛在的至癌物質(zhì)，試驗(yàn)時帶手套，使用后適當(dāng)處理。對MAIPAN4510板，孵育時由于毛細(xì)作用，試劑滲入膜中，此液體難以洗去，因此導(dǎo)致背景增加。為了避免此情況，建議在步驟12時將板底移去，將膜倒轉(zhuǎn)，用蒸餾水流沖洗，同時用洗滌緩沖液按正常的步驟洗滌。 

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