二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林
1 前言我們對二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林離子交換柱進(jìn)行了可行性實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果顯示：離子交換柱使用方便，色譜柱的再生也比較簡單，色譜圖峰形對稱性好，且雜質(zhì)的分離度明顯優(yōu)于C18柱。用此種方法對利巴韋林及其十余種制劑進(jìn)行了含量及有關(guān)物質(zhì)的測定，均獲得了滿意的結(jié)果。利巴韋林及其系列制劑為廣譜抗病毒藥，其原料藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于中國藥典2000年版二部，含量測定用反相二手高效液相儀法，采用C18色譜柱，流動相為水或0.03mol/L硫酸溶液，測定波長為207nm。利巴韋林制劑共有10個品種，其含量測定除兩個品種采用定氮法外，其余均采用高效液相法，所使用的條件與原料藥相同。但是二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林測定利巴韋林測定所使用的流動相中未加甲醇一類的有機(jī)相，具有不可調(diào)節(jié)，選擇性差等缺點(diǎn)；同時在做有關(guān)物質(zhì)測定時，雜質(zhì)與主峰的分離度不好，特別是注射液中含有氯化鈉時，其結(jié)果是，C18柱的柱壓不斷增高，而柱效卻在不斷降低。
2 實(shí)驗(yàn)部分
2.1 試劑和儀器
二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林Waters2695高效液相色譜儀，Waters2996二極管陣列檢測器，Empower工作站軟件
二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林，利巴韋林對照品，由中國生物制品檢定所提供，批號為629-200202。水：二次重蒸過濾水。硫酸：分析純。
2.2 二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：色譜操作條件
色譜柱為氫型強(qiáng)陽離子交換樹脂，磺化交聯(lián)的苯乙烯二乙烯苯共聚物的離子交換柱（型號LZD SL17，北京龍智達(dá)公司提供），7.8mm×100mm。流動相為水（用稀硫酸調(diào)節(jié)PH2.5±0.1）；檢測波長207nm；靈敏度為0.01（AUFS）。在此條件下，樣品與雜質(zhì)可實(shí)現(xiàn)基線分離。
以上操作參數(shù)是典型的，可以根據(jù)不同儀器特點(diǎn)，對給定操作參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整，以期獲得*佳效果，在上述操作條件下，利巴韋林測定的典型高效液相色譜圖如圖1所示。
2.3測定步驟
2.3.1標(biāo)樣溶液的配制
二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：取利巴韋林對照品約25mg（**至0.0002g），置25ml容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取3.0置于50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，備用。
2.3.2樣品溶液的配制
二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：稱取利巴韋林樣品25mg（**至0.0002g）于25mL容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取3.0置于50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻，備用。
圖1 利巴韋林HPLC測定典型色譜圖
圖2 利巴韋林HPLC測定典型色譜圖（前面小峰為氯化鈉）
2.3.3測定
在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，計算相對響應(yīng)值變化小于1.0%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)行測定。
按外標(biāo)法公式進(jìn)行計算。
3 結(jié)果與討論
3.1 *佳操作條件的選擇
取利巴韋林對照品，加流動相制成約25μg/ml的溶液，在200-300的波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，利巴韋林在207nm波長處有*大吸收，故測定波長仍確定為207nm。
為確保樣品與雜質(zhì)的完全分離，且分析周期短，分析成本低，經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)流動相為水（用稀硫酸調(diào)節(jié)PH2.5±0.1）時能滿足上述要求，基線平穩(wěn)且峰型對稱，與其它雜質(zhì)峰沒有重疊，得到了較好的分離效果。
3.2 分析方法線性相關(guān)性的測定
取利巴韋林對照品約25mg，精密稱量，置25ml容量瓶中，二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml置于50ml容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，分別吸取上述溶液各20μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以利巴韋林濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為A=1894C+1755，相關(guān)系數(shù)r=0.9998。結(jié)果表明利巴韋林在30-70μg/ml范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。
3.3方法的精密度和準(zhǔn)確度
平行稱取試樣5份，按上述色譜條件測得利巴韋林標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.44；在已知含量的利巴韋林樣品中加入一定數(shù)量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測得利巴韋林的平均回收率為99.72%，說明該方法準(zhǔn)確度良好。
3.4有關(guān)物質(zhì)檢測條件的方法及驗(yàn)證
3.4.1 *低檢出量
將利巴韋林對照品溶液，逐步稀釋，在上述色譜條件下經(jīng)驗(yàn)20μl，以基線信號峰3倍峰高為*低檢出限，二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：測得利巴韋林的*低檢出量為0.3ng。
3.4.2 拖尾因子及分離度實(shí)驗(yàn)
取利巴韋林原料，制成0.4mg/ml的溶液，并加入已知雜質(zhì)馬嘌呤，在上述色譜條件下測定，記錄色譜圖，計算拖尾因子及分離度，拖尾因子為1.0，利巴韋林主峰和各雜質(zhì)峰之間的分離度大于5，均符合中國藥典2000年版的規(guī)定。
方法名稱： 利巴韋林口服溶液－利巴韋林－高效液相色譜法
應(yīng)用范圍： 本方法采用高效液相色譜法測定利巴韋林原料藥中利巴韋林的含量。
本方法適用于利巴韋林原料藥。
方法原理： 供試品經(jīng)水稀釋，二手高效液相色譜儀檢測利巴韋林：進(jìn)入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測器，于波長207nm處檢測利巴韋林的峰面積，計算出其含量。
試劑： 水
儀器設(shè)備： 1. 儀器
1.1 高效液相色譜儀
1.2 色譜柱
十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，理論塔板數(shù)按利巴韋林峰計算應(yīng)不低于2500。
1.3 紫外吸收檢測器
2. 色譜條件
2.1 流動相：水
2.2 檢測波長：207nm
2.3 柱溫：室溫
試樣制備： 1. 對照品溶液的制備
精密稱取利巴韋林對照品適量，加水稀釋制成每1mL中約含30µg的溶液，即為對照品溶液。
2. 供試品溶液的制備
精密稱取供試品適量（約相當(dāng)于利巴韋林150mg），加水稀釋成每1mL中約含利巴韋林30µg的溶液，即為供試品溶液。
注：“精密稱取”系指稱取重量應(yīng)準(zhǔn)確至所稱取重量的千分之一。“精密量取”系指量取體積的準(zhǔn)確度應(yīng)符合國家標(biāo)準(zhǔn)中對該體積移液管的精度要求。
操作步驟： 分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20mL，注入高效液相色譜儀，用紫外吸收檢測器于波長207nm處測定利巴韋林（C8H12N4O5）的峰面積，計算出其含量。