PCR/RT-PCR基本原理及常用試劑耗
PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構(gòu)成：

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加 熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。

PCR反應五要素： 參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

PCR/RT-PCR常用試劑與耗材：

1.DEPC  10ml                sigma分裝      原價：160

2.溴化乙錠EB  1g            sigma分裝      原價：210 

3.噻唑蘭MTT  250mg               sigma分裝        原價：210

4.二甲基亞楓DMSO  100ml          sigma分裝        原價：140 

5.Ivitrogen脂質(zhì)體2000  0.75ml    Ivitrogen原裝    原價：3100

6.0.2mlPCR管  1000支/袋          國產(chǎn)             原價：45

7.1.5ml離心管  500支/袋     國產(chǎn)   原價：45 

8.10微升、200微升、1000微升吸頭, 以上吸頭都是15元/包  1000個/包  贈送吸頭盒一個。

9.RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒          20T        MBI原裝                    原價：400

10.PCR試劑盒              100T       現(xiàn)在只有200T包裝，MBI原裝  原價：460 

11.100-1500bp DNA Marker  50T        北京天跟                   原價：160  貨號：MD109-01

12.總RNA提取Trizol        100ml      Ivitrogen原裝              原價：1900 

13.瓊脂糖100g             100g       西班牙原裝                 原價：460