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含量測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

含量測(cè)定方法的評(píng)價(jià)

任何一種含量測(cè)定方法的評(píng)價(jià)，根據(jù)其使用的對(duì)象和要求，都應(yīng)有相應(yīng)的效能指標(biāo)。一般常用的分析效能評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、定量限、選擇性、線性與范圍、重現(xiàn)性、耐用性等；測(cè)定方法的效能指標(biāo)可以作為對(duì)分析測(cè)定方法的評(píng)價(jià)尺度也可以作為建立新的測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)研究依據(jù)。

a、精密度(precision) 
系指用該法測(cè)定同一勻質(zhì)樣品的一組測(cè)量值彼此符合的程度。它們?cè)浇咏驮骄?。?*分析中，常用 標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(standard deviation，SD或S)； 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)(偏)差(relative standard 
deviation，RSD)，也稱變異系數(shù)(coefficient of variation，CV)，表示。
    生物樣品分析時(shí)，常用RSD表示精密度，并可細(xì)分為批內(nèi)(或日內(nèi))精密度及批間(或日間)精密度。
批內(nèi)精密度(within-run precision)：是同一次測(cè)定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品各7-10份，每種濃度的樣品按所擬定的分析方法操作，一次開機(jī)后，一一測(cè)定。計(jì)算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批內(nèi)精密度也可視為日內(nèi)精密度(with- in-day precision)。所得RSD應(yīng)爭(zhēng)取達(dá)到5％以內(nèi)，但不能超過10%。
批間精密度(between-run precision)：是不同次測(cè)定的精密度。通常采用高、中、低三種濃度的同一樣品，每種濃度配制7-10份，置冰箱冷凍。自配制樣品之日開始，按所擬定的分析方法操作，每天取出一份測(cè)定，計(jì)算每種濃度樣品的SD值及RSD值。批間精密度也可視為日間精密度(day to day precision)。所得RSD應(yīng)控制在15％以內(nèi)。
b 、準(zhǔn)確度(accuracy) 
是指測(cè)得結(jié)果與真實(shí)值接近的程度，表示分析方法測(cè)量的正確性。
    由于“真實(shí)值”無法準(zhǔn)確知道，因此，通常采用回收率試驗(yàn)來表示。生物**分析中，常用標(biāo)準(zhǔn)添加法來計(jì)算回收率，即取已準(zhǔn)確測(cè)定**含量P (present)的真實(shí)樣品(如人血漿樣品等)，再加入**標(biāo)準(zhǔn)品已知量A (added)，混合物作為測(cè)定液，其測(cè)定值為M (measured)。測(cè)定液要配制成高、中、低三種濃度，每個(gè)濃度測(cè)定3-5次，求出每種濃度的平均測(cè)定值M，且RSD應(yīng)符合要求。由于預(yù)先要準(zhǔn)確測(cè)定樣品中原含有的**量P，因此也應(yīng)測(cè)定3-5次，求其平均值P，且RSD應(yīng)符合要求。
    回收率＝ （測(cè)定液平均測(cè)定值M - 原樣品液含量平均值P）/ 加入量A×100％
    回收率結(jié)果越接近100％表明分析方法準(zhǔn)確度越高。生物樣品分析時(shí)，一般控制回收率范圍應(yīng)為85％-115％(樣品藥濃＞200ug／L)及80%-120％(樣品藥濃＜200ug／L)。
制劑的含量測(cè)定時(shí)，采用在空白輔料中加入原料藥對(duì)照品的方法作回收試驗(yàn)及計(jì)算RSD，還應(yīng)作單獨(dú)輔料的空白測(cè)定。每份均應(yīng)自配制模擬制劑開始，要求至少測(cè)定高、中、低三個(gè)濃度，每個(gè)濃度測(cè)定三次，共提供9個(gè)數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
回收率＝（平均測(cè)定值M -空白值B）/ 加入量A×100％
    回收率的RSD一般應(yīng)為2％以內(nèi)。
c．檢測(cè)限(limit of detection，LOD)
是指分析方法能夠從背景信號(hào)中區(qū)分出**時(shí)，所需樣品中**的*低濃度，無需定量測(cè)定。
    LOD是一種限度檢驗(yàn)效能指標(biāo)，它既反映方法與儀器的靈敏度和噪音的大小，也表明樣品經(jīng)處理后空白(本底)值的高低。要根據(jù)采用的方法來確定檢測(cè)限。當(dāng)用儀器分析方法時(shí)，可用已知濃度的樣品與空白試驗(yàn)對(duì)照，記錄測(cè)得的被測(cè)**信號(hào)強(qiáng)度S與噪音(或背景信號(hào))強(qiáng)度N，以能達(dá)到S／N＝2或S／N＝3時(shí)的樣品*低藥濃為L(zhǎng)OD；也可通過多次空白試驗(yàn)，求得其背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差，將三倍空白標(biāo)準(zhǔn)差(即3δ空或3S空)作為檢測(cè)限的估計(jì)值。為使計(jì)算得到的LOD值與實(shí)際測(cè)得的LOD值一致，可應(yīng)用校正系數(shù)(f)來校正，然后依之制備相應(yīng)檢測(cè)限濃度的樣品，反復(fù)測(cè)試來確定LOD。如用非儀器分析方法時(shí)，即通過已知濃度的樣品分析來確定可檢出的*低水平作為檢測(cè)限。
d．定量限 (limit of quantitation，LOQ)
是指在保證具有一定可靠性(一定準(zhǔn)確度和精密度)的前提下，分析方法能夠測(cè)定出的樣品中**的*低濃度。
    它反映了分析方法測(cè)定低**濃度樣品時(shí)具有的可靠性。它與上述的檢測(cè)限的差別在于：定量限要定量測(cè)定某一**在樣品介質(zhì)中的*低濃度，且定量限規(guī)定的*低濃度應(yīng)該符合一定的精密度和準(zhǔn)確度的要求。確定定量限的方法也因所用方法不同而異。當(dāng)用非儀器分析方法時(shí)，與上述檢測(cè)限的確定方法相同；如用儀器分析方法時(shí)，則往往將多次空白試驗(yàn)測(cè)得的背景響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)差(即空白標(biāo)準(zhǔn)差)乘以10，作為定量限的估計(jì)值，繼之，再通過分析適當(dāng)數(shù)量已知接近定量限或以定量限制備的樣品來驗(yàn)證。
e．選擇性(selectivity)
是指在樣品介質(zhì)中有其他組分共存時(shí)該分析方法對(duì)供試物質(zhì)準(zhǔn)確而專屬的測(cè)定能力。
    它與專屬性(specificity)的含義稍有不同。專屬性是指一種方法僅對(duì)一種分析成分產(chǎn)生**信號(hào)；選擇性則可對(duì)多種化學(xué)成分產(chǎn)生不同響應(yīng)，而主要成分的響應(yīng)可與其它響應(yīng)區(qū)分。
    因此，選擇性是指該法用于復(fù)雜樣品分析時(shí)相互干擾程度的量度。
    在**分析中考察一個(gè)分析方法的選擇性時(shí)，應(yīng)著重考慮雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、相關(guān)化合物以及制劑輔料等其他組分是否對(duì)被測(cè)**的測(cè)定有干擾。一般，通過添加上述物質(zhì)的樣品與未曾添加的樣品所得分析結(jié)果進(jìn)行比較而確定。
f．線性與范圍 (linearity and range)
分析方法的線性是在給定范圍內(nèi)獲取與樣品中供試物濃度成正比的試驗(yàn)結(jié)果的能力。換句話說，就是供試物濃度的變化與試驗(yàn)結(jié)果(或測(cè)得的響應(yīng)信號(hào))成線性關(guān)系。
     所謂線性范圍是指利用一種方法取得精密度、準(zhǔn)確度均符合要求的試驗(yàn)結(jié)果，而且成線性的供試物濃度的變化范圍，其*大量與*小量之間的間隔，可用mg／L ~ mg／L、 ug／ml ~ ug／ml等表示。
    線性與范圍的確定可用作圖法(響應(yīng)值Y／濃度X)或計(jì)算回歸方程(Y＝a+bX)來研究建立。
    測(cè)定樣品時(shí)所有生物**分析方法都必須同時(shí)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。每次作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，方法應(yīng)與分析方法考核時(shí)完全一致。標(biāo)準(zhǔn)濃度應(yīng)包括一定梯度的5-8個(gè)濃度(非線性者如**分析可適當(dāng)增加)，每個(gè)濃度只需測(cè)定一次(**分析可測(cè)定兩次并取均值)；標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)覆蓋樣品可能的濃度范圍，對(duì)于含量測(cè)定要求一般濃度上限為樣品*高濃度的120％，下限為樣品*低濃度的80％ (但應(yīng)高于LOQ)；目前仍廣泛采用相關(guān)系數(shù)(r)表示標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性度、并控制r≥0.9900。對(duì)照品的LOQ必須包括在線性范圍。
g. 耐用性 (robustness)
    是指利用相同的方法在各種正常實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)同一樣品進(jìn)行分析所得結(jié)果的重現(xiàn)程度。
    所謂各種正常實(shí)驗(yàn)條件，包括不同的實(shí)驗(yàn)室、不同的分析人員、不同的儀器、不同批號(hào)的試劑、不同的測(cè)試耗用時(shí)間、不同的分析溫度、不同的測(cè)定日期等等。分析方法重現(xiàn)性的測(cè)定是通過在不同實(shí)驗(yàn)室由不同的實(shí)驗(yàn)者(操作和環(huán)境條件雖有差別但仍在規(guī)定的分析參數(shù)內(nèi))對(duì)同一樣品的分別測(cè)試而獲得的。
h、重現(xiàn)性 (ruggedness) 
即是指在不同實(shí)驗(yàn)室中使用此種分析方法的精密度。
是評(píng)價(jià)其保持不受參數(shù)微小變差影響的能力，并可作為正常使用的一個(gè)可靠性指標(biāo)。
i. 與參比方法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度的比較
    由于生物樣品中含有許多干擾測(cè)定的雜質(zhì)，特別是與原型**相似的代謝物常對(duì)**的測(cè)定有影響。因此，除考察選擇性外，有時(shí)還用參比方法對(duì)實(shí)際生物樣品同時(shí)測(cè)定并進(jìn)行比較。比較試驗(yàn)時(shí)，取若干份實(shí)際樣品 
    (如病人服藥后采取的血樣)，用一個(gè)已證明有相當(dāng)專屬性和可靠性的方法與新建立的方法同時(shí)進(jìn)行測(cè)定，以參比方法測(cè)得的藥濃為橫坐標(biāo)(X)，以新建立方法測(cè)得的藥濃為縱坐標(biāo)(Y)作成散布圖(scatter diagram)，并求出直線回歸方程 (y＝a+bx)及相關(guān)系數(shù) (r)。r*大值為1，表示兩法完全相關(guān)(結(jié)果完全吻合)；r＝0時(shí)，表示兩法完全不相關(guān)。一般要求兩法的相關(guān)系數(shù)r＞0．95，而相關(guān)直線的斜率 (b) 應(yīng)接近于1。
    評(píng)價(jià)一種分析方法的效能，并不一定對(duì)上述各項(xiàng)指標(biāo)都有要求。一般．根據(jù)方法的使用對(duì)象有所區(qū)別。大體上有以下四種情況：
A．用于原料藥中主要組分或制劑中有效組分含量測(cè)定的方法：除了檢測(cè)限和定量限二項(xiàng)指標(biāo)外，對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、耐用性等均應(yīng)有所要求；
B．用于原料藥中雜質(zhì)測(cè)定或制劑中降解產(chǎn)物測(cè)定的方法又可分為兩種：①用于含量測(cè)定；②用于限度檢查。
    對(duì)于①法的要**：除檢測(cè)限和精密度指標(biāo)不必要求外，對(duì)準(zhǔn)確度、選擇性、線性與范圍、定量限、耐用性等均應(yīng)有所要求；
    對(duì)于②法的要**：只??檢測(cè)限、選擇性和耐用性三項(xiàng)指標(biāo)有所要求，其余均無需要 求。
C．用于溶出度測(cè)定的方法及**釋放度測(cè)定的方法，只有精密度和耐用性有所要求，其余項(xiàng)目均不作要求。
D．用于生物樣品中**測(cè)定的方法，對(duì)精密度、準(zhǔn)確度、檢測(cè)限、選擇性、可測(cè)線性范圍、定量限、對(duì)生物樣品的耐用性以及與參比方法測(cè)得結(jié)果的相關(guān)程度的比較等指標(biāo)應(yīng)有所要求。