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技術(shù)文章

DNA提取 I：土壤的分子生物學(xué)特性
    鑒于細(xì)節(jié)內(nèi)容篇幅較長(zhǎng)，此文章將分成兩個(gè)部分。部分著重介紹研磨均質(zhì)使用的研磨珠、研磨設(shè)備和裂解緩沖液。**部分介紹選擇化學(xué)溶液以獲得好的DNA吸附綁定、清洗和抽提效果。

    MO BIO實(shí)驗(yàn)室用于提取土壤DNA的試劑盒有好幾種。而PowerSoil DNA Isolation Kit 是效果好，受歡迎的一個(gè)。因此，在下面文章了將主要針對(duì)它來(lái)討論。此試劑盒采用了的抑制因子去除技術(shù)（IRT技術(shù)）來(lái)去除多糖多酚等腐植質(zhì)，使用了小型的離心過(guò)濾柱和微型離心機(jī)。

    需要注意的是，不同土壤微生物含量和有機(jī)物含量差異很大，DNA得率也就有差別。得率不單單是由樣品起始量來(lái)決定，來(lái)自同一塊泥土不同土層深度的樣品微生物含量、有機(jī)物組成也會(huì)大不同。

    想保證每個(gè)樣品得率一致很困難，因?yàn)槊跨P泥土可能含有不一樣多的樹葉、殘骸、昆蟲，甚至小石子、沙子。在MO BIO實(shí)驗(yàn)室里，我們通常要對(duì)土壤樣品進(jìn)行過(guò)篩，去掉大塊，保證每個(gè)樣品質(zhì)地一致。如果樣品的一致性對(duì)你的實(shí)驗(yàn)影響比較大，過(guò)篩是必須的。

    這點(diǎn)很重要，加大樣品起始量，并不總是意味著可以獲得更多的DNA。因?yàn)樘嗟臉悠窌?huì)吸收掉大部分裂解緩沖液，使得研磨效率驟降。加大樣品起始量只能對(duì)個(gè)別類型土壤來(lái)說(shuō)可行。PowerSoil DNA Kit 是小量提取試劑盒。如果你需要提取多于0.25g的土壤，MO BIO了像PowerMax® Soil DNA Kit這樣提10g土壤的，RNA PowerSoil® Kit和配套的DNA Elution Accessory Kit一次提取2g土壤。

    接下來(lái)，我們順著DNA提取過(guò)程一步一步講解。首先是裂解，尤其是機(jī)械法裂解。

步驟一：裂解:

獲得高得率完整DNA需要強(qiáng)而有力的裂解。選擇研磨珠種類以及機(jī)械研磨時(shí)間需要掌握一個(gè)平衡，使得在打開微生物細(xì)胞的同時(shí)盡量減少對(duì)DNA的剪切破損。使用研磨珠擊打破碎若配合溫度改變，可以強(qiáng)化裂解作用，對(duì)于堅(jiān)硬的有機(jī)物和孢子等的裂解有很大幫助。

研磨珠類型：

適合裂解土壤微生物的研磨珠有很多種。研磨珠的類型，外形，大小都會(huì)影響到DNA的得率和完整性。

MO BIO偏向喜歡用大小不一、邊緣鋒利的石榴石研磨珠。就因?yàn)檠心ブ榇笮〔灰?，既可以打碎大塊泥土，也可以照顧到小小的微生物細(xì)胞。石榴石質(zhì)地較軟，在使用高速珠磨研磨機(jī)的時(shí)候會(huì)崩裂成很多小塊。許多客戶為了加強(qiáng)提取**DNA的機(jī)械裂解力，而在FastPrep o或Precellys上使用，也能獲得很好的效果。

高速?gòu)?qiáng)力珠磨設(shè)備長(zhǎng)時(shí)間擊打研磨，需要使用0.5mm或0.1mm玻璃研磨珠。雖然這類研磨珠會(huì)加重DNA破損，但是用于孢子類堅(jiān)硬有機(jī)物的裂解是有幫助的。你也可以混合使用大小不一樣的玻璃和石榴石做一個(gè)適合自己樣品的研磨珠混搭。

研磨設(shè)備：

前面文章也提到過(guò)，渦旋儀研磨法是獲得完整DNA省錢的研磨方法。實(shí)驗(yàn)證明，配合我們的裂解緩沖液處理0.25g土壤樣品，10min的渦旋時(shí)間是合適的。延長(zhǎng)渦旋時(shí)間并不能增加得率，反而讓DNA破損增大。

Precellys 或 FastPrep也是個(gè)不錯(cuò)的選擇，如果你的實(shí)驗(yàn)室有，并希望加強(qiáng)裂解效果。大多數(shù)客戶提取**、**DNA的時(shí)候，把FastPrep調(diào)到5檔，研磨45s到1min。FastPrep上的5檔相當(dāng)于Precellys的5200rpm。也有些客戶喜歡用4檔（相當(dāng)于Precellys的5000rpm），每個(gè)樣品15-30s，3~4個(gè)循環(huán)。由此可以看到，使用強(qiáng)力珠磨研磨設(shè)備，還需要根據(jù)手上樣品的具體情況調(diào)整研磨方案。文章尾部列舉了一些在FastPrep上使用MO BIO UltraClean Soil 或 PowerSoil Kits的相關(guān)文獻(xiàn)，供參考。

裂解緩沖液:

另一個(gè)組成強(qiáng)力裂解力量崩開細(xì)胞的重要成分是"溶液"。這個(gè)溶液必須滿足3個(gè)條件。，聯(lián)合機(jī)械作用力瓦解細(xì)胞膜。二，性質(zhì)柔和不損傷DNA。三，不受土壤本身pH的印象。必須緩沖掉土壤本身的酸性，因?yàn)樗嵝詶l件對(duì)DNA有害。裂解緩沖液結(jié)合C1或者S1（分別是PowerSoil 和UltraClean Soil kits）了裂解所有類型土壤微生物的佳條件。

加熱？

在需要強(qiáng)力裂解的情況下，撇開高速?gòu)?qiáng)力注珠磨研磨機(jī)和玻璃研磨珠不說(shuō)，研磨前加熱樣品對(duì)于提取是有幫助的。接入裂解緩沖液以后，65℃-70℃孵育10-15min可以弱化細(xì)胞膜，利于研磨破碎。對(duì)**、孢子尤其有效。

另一個(gè)方法是從-20°C 或 -80°C 到 37°C對(duì)土壤樣品反復(fù)凍融3次。此方法同樣能增強(qiáng)細(xì)胞的破碎。當(dāng)然，實(shí)施起來(lái)就沒(méi)有上面提到的加熱法方便。

總結(jié):

好了，已經(jīng)說(shuō)了很多。總的來(lái)說(shuō)，裂解步驟就是聯(lián)合研磨珠+研磨設(shè)備+緩沖液儀器對(duì)樣品進(jìn)行裂解并極大程度上影響DNA的得率和完整性。各個(gè)環(huán)節(jié)都是很靈活的，你可以根據(jù)樣品的實(shí)際情況做調(diào)整。而無(wú)論提取動(dòng)物組織RNA、微生物純培養(yǎng)DNA、生物薄膜（Biofilm）DNA或RNA，道理都是一樣的。

還好，有MO BIO labs R & D科學(xué)家們花大量時(shí)間為做各種環(huán)境樣品提取條件的優(yōu)化，反過(guò)來(lái)就是節(jié)約了您寶貴的實(shí)驗(yàn)時(shí)間。

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