**印跡immunoblotting又稱(chēng)蛋白質(zhì)印跡western blot，它是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測(cè)復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法。western blot是在凝膠電泳和固相**測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的**生化技術(shù)。由于**印跡western blot具有SDS-PAGE的高分辨力和固相**測(cè)定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù)。**印跡western blot常用于鑒定某種蛋白，并能對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。

閃晶生物為您全套**印跡western blot技術(shù)服務(wù)和相關(guān)的試劑耗材。主要實(shí)驗(yàn)步驟如下：

• 蛋白質(zhì)抽提
  • 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（250~500mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑），勻漿后抽提總蛋白（或核蛋白）。
  • 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加0.1ml~1ml含蛋白酶抑制劑的總蛋白抽提試劑（或核蛋白抽提試劑）抽提總蛋白（或核蛋白）。

2.蛋白質(zhì)定量：按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒操作說(shuō)明操作，測(cè)定樣品濃度。
3.變性聚丙烯酰胺不連續(xù)凝膠電泳SDS-PAGE:將準(zhǔn)備好的樣品液和預(yù)染蛋白marker分別上樣，標(biāo)準(zhǔn)加進(jìn)個(gè)孔中，電泳分離蛋白。
4. 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜,按Bio-Rad蛋白轉(zhuǎn)移裝置說(shuō)明組裝濾紙凝膠纖維素夾層，30mA恒流條件下，4°C轉(zhuǎn)移過(guò)夜。
5. western blot膜的封閉和抗體孵育

• 膜在5％脫脂奶粉溶液中室溫孵育1小時(shí)以封閉膜上的非特異結(jié)合。
• 封閉過(guò)的膜加入一抗室溫孵育1.5小時(shí)，抗原抗體結(jié)合。
• 加入HRP標(biāo)記的二抗體以結(jié)合一抗，室溫孵育膜1小時(shí)。加入HRP標(biāo)記的GAPDH抗體可同時(shí)檢測(cè)GAPDH含量。

6. westernblot結(jié)果檢測(cè)：化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，膜與化學(xué)發(fā)光底物孵育，經(jīng)X膠片曝光顯影。圖片掃描保存為電腦文件，并用GIS1000分析軟件將圖片上每個(gè)特異條帶灰度值的數(shù)字化。
7. westernblot數(shù)據(jù)分析：目的蛋白的灰度值除以?xún)?nèi)參GAPDF的灰度值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的蛋白相對(duì)含量。
8. 實(shí)驗(yàn)報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及**印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)數(shù)據(jù)。
更詳細(xì)的操作說(shuō)明

westernblot費(fèi)用：每張膜上做一種目的蛋白和相應(yīng)的內(nèi)參蛋白。每張膜上可以做8個(gè)樣品。每張膜的費(fèi)用是：1500.00元。一抗另計(jì)，其它試劑免費(fèi)，一抗訂購(gòu)時(shí)間約為3周。乘車(chē)路線(xiàn)：火車(chē)站坐1號(hào)地鐵到終點(diǎn)站，然后換5號(hào)地鐵坐到北橋站即可。
時(shí)間：約2－3周。

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