基線是PCR擴增早期熒光信號穩(wěn)定的水平階段（通常為3-15個循環(huán)），反映背景噪聲。閾值是判斷熒光信號進入指數(shù)增長期的臨界值，默認設(shè)置為基線信號標準偏差的10倍，其與擴增曲線的交點即為Ct值。實時熒光定量PCR（qPCR）的基線和閾值調(diào)整是確保實驗結(jié)果準確性的關(guān)鍵步驟。以下是手動調(diào)整基線和閾值的一般指南：

一、手動調(diào)整基線的步驟：

1、確定基線范圍：通常，基線設(shè)置在循環(huán)數(shù)3到15之間，確保背景噪聲被正確識別。

2、檢查背景信號：基線的*小值應(yīng)設(shè)置在背景噪聲的尾巴之后，*大值應(yīng)設(shè)置在擴增起始點之前。循環(huán)范圍在5個循環(huán)內(nèi)即可。

3、特殊情況處理：

①　如果樣本擴增曲線剛好在基線*大值處開始，不需要調(diào)節(jié)基線。

② 對于濃度*高的樣本，如果Ct值小于15，也不需要調(diào)節(jié)基線。

③ 如果*高濃度樣本的擴增曲線起始點在基線*大值之前，表明基線太高，可以將基線結(jié)束值調(diào)小1～2個循環(huán)。

④ 如果*高濃度樣本的擴增曲線起始點距離基線*大值太遠，表明基線太低，可以將基線結(jié)束值調(diào)大1～2個循環(huán)。

二、手動調(diào)整閾值的步驟：

1、在基線設(shè)置完成后，系統(tǒng)自動**默認閾值線。

2、取消“Automatic Threshold”選項，切換為手動模式。

3、將閾值線拖動至基線期后、指數(shù)增長期內(nèi)，確保與擴增曲線相交于斜率*大處。

4、驗證所有樣品的Ct值均落在指數(shù)增長期，避免進入平臺期。

三、常見問題處理：

?基線異常?：若擴增曲線因基線設(shè)置錯誤出現(xiàn)抬升，需手動調(diào)整基線起止循環(huán)至信號穩(wěn)定區(qū)域?。

?閾值異常?：閾值過低會導致Ct值不準確，過高可能遺漏弱陽性信號。

四、注意事項：

使用SYBR Green染料時需注意非特異性擴增對閾值的影響。

耗材或試劑污染可能導致基線波動，需檢查反應(yīng)管密封性及液面高度。

通過上述步驟，可以手動調(diào)整基線和閾值，確保qPCR數(shù)據(jù)的準確性和可靠性。