PCR反應(yīng)的控制:

1. PCR反應(yīng)的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子

2. 鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L

3. 底物濃度 dNTP以等摩爾濃度配制，20～200umol/L

4. TaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）

5. 引物 濃度一般為0.1 ～ 0.5umol/L

6. 反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)

· 變性溫度和時(shí)間 95℃，30s

· 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃

· 延伸溫度和時(shí)間 72℃，1min/kb(10kb內(nèi)）

· Tm值=4(G+C) +2(A+T)

循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)數(shù)超過(guò)30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”