熒光定量PCR（Real-time PCR），是指在PCR擴增反應體系中加入熒光基團，通過對擴增反應中每一個循環(huán)產(chǎn)物熒光信號的實時檢測,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。反應中對照的目的是對檢測的各個環(huán)節(jié)進行監(jiān)控，因此我們按照檢測的流程對對照進行梳理。沒有一種對照是wan美的，在檢測中我們要根據(jù)自己的需求來進行靈活選擇和搭配。建議每一次檢測時添加一個能對從提取到擴增環(huán)節(jié)進行監(jiān)控的質(zhì)控品或標準物質(zhì)；每份檢測樣品中添加內(nèi)標（如果樣品種類比較多樣建議使用人工內(nèi)標，如果樣品類型為相對固定的動物組織建議使用內(nèi)參基因）；擴增陽性對照，擴增陰性對照，無模板對照和ROX對照。有條件的添加臨床陽性對照和臨床陰性對照，在懷疑提取環(huán)節(jié)或者反轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題時使用核酸提取對照和反轉(zhuǎn)錄對照。不定期使用儀器空白對照。

一、陽性對照與污染

     不可否認的一個事實是陽性對照可以增加實驗室污染的風險。這種污染的來源一種是直接來源于擴增陽性對照的污染。對于擴增陽性對照來說通常10000拷貝/微升（CT值約25）是比較理想的，但是有一些試劑盒廠家的擴增陽性對照設置在CT值20以下，比大部分陽性樣本都強。這么高濃度的對照給實驗室?guī)砹司薮蟮奈廴撅L險，原因可能僅僅是因為試劑廠家擔心其陽性對照不穩(wěn)定，長時間存放陽性對照降解。另一種污染來自于擴增產(chǎn)物的處理不當，或者實驗室的設計布局不合理。

二、初篩和確診

   對照與實驗目的的關系好像從來沒有人提及過。根據(jù)筆者多年在檢測實驗室的經(jīng)驗，分享一點個人的心得，歡迎大家批評指正。

對于初篩實驗，我們希望提高真陽性檢出率，即提高診斷敏感性。我們需要檢測系統(tǒng)達到高檢測效率，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陽性對照，確保每個環(huán)節(jié)的檢測效率高。

   對于確診實驗，我們希望提高真陰性檢出率，即提高診斷特異性。我們需要確保檢測系統(tǒng)不出現(xiàn)假陽性，因此要在不同環(huán)節(jié)添加陰性對照，減少非必須的陽性對照，甚至要在樣品盤的不同位置中隨機插入幾個陰性對照，確保實驗過程中沒有被污染。