PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟：
方法
1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     
10×PCR buffer                   
5 μl     dNTP mix （2mM）             
4 μl     引物1（10pM）                 
2 μl     引物2（10pM）                 
2 μl     Taq酶 （2U/μl）               
1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  
1 μl      加ddH2O至 50 μl  
產(chǎn)品特點(diǎn): 本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
靈敏度高：可檢測個(gè)位拷貝數(shù)的基因
特異性高：有效避免非特異性擴(kuò)增的出現(xiàn)
穩(wěn)定性高：復(fù)孔間差異小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性強(qiáng)
擴(kuò)增性能優(yōu)：擴(kuò)增效率高，熒光信號強(qiáng)

儲存條件：
僅用于科研14℃或－20℃樣品收集、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)**的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000 轉(zhuǎn)離心30 分鐘取上清。
3. 細(xì)胞上清液：3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000 轉(zhuǎn)離心10 分鐘取上清。
5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。zui好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾高壓。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對照+1管陽性對照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14μL N×14μL
酶混合物 1 μL N×1 μL
總量 15 μL N×15μL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對照(NTC)和陽性對照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。

人滑膜細(xì)胞RNAHS miRNA5 μg丙谷胺（標(biāo)準(zhǔn)品）Proglumide質(zhì)量規(guī)格：含量測定

LRRN3 Others Human 人 LRRN3 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) GW501516GW501516(GSK-516; GW1516)質(zhì)量規(guī)格：>98%,高度選擇性的PPARβ/δ激動劑

牛胚氣管細(xì)胞;EB (NBL-4)布洛芬（標(biāo)準(zhǔn)品）Ibuprofen質(zhì)量規(guī)格：含量測定

A172細(xì)胞，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 肝細(xì)胞癌,HepG2細(xì)胞 人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞;COLO 205比沙可啶（標(biāo)準(zhǔn)品）Bisacodyl質(zhì)量規(guī)格：含量測定

小鼠肉瘤瘤株;S180醋酸氯己定（標(biāo)準(zhǔn)品）Chlorhexidine Acatate質(zhì)量規(guī)格：含量測定
CTLL-2細(xì)胞，小鼠T細(xì)胞 人前列腺癌細(xì)胞,9L-B細(xì)胞 人絨毛間葉成纖維細(xì)胞RNAHVMF miRNA5 μg阿瑞匹坦-M3代謝物Aprepitant-M3 Metabolite質(zhì)量規(guī)格：美國進(jìn)口

恒河猴皮膚細(xì)胞;RM-S1O-芐基-L-酪氨酸芐酯鹽酸鹽O-Benzyl-L-tyrosine benzyl ester 質(zhì)量規(guī)格：0.985

EPHB2 Others Human 人 EphB2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) O-芐基-L-酪氨酸甲酯鹽酸鹽O-Benzyl-L-tyrosine methyl ester 質(zhì)量規(guī)格：0.985

人腸微血管內(nèi)皮細(xì)胞總RNAHIMEC NAL-正纈氨酸叔丁酯鹽酸鹽L-Valine t-butyl ester 質(zhì)量規(guī)格：0.99

AARS Others Mouse 小鼠 AARS / alanyl-NA syhetase 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 4-硝基-L-苯丙氨酸4-Nitro-L-phenylalanine monohydrate質(zhì)量規(guī)格：0.98
人胎盤絨膜癌細(xì)胞;BeWo神經(jīng)酸苷酶，英文名或英文縮寫：Neuneminidase，級別：BR，90u/mg，芬末，規(guī)格：25克

REG3A Others Human 人 REG3A / HIP 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 甲環(huán)酸 Tranexamic acid,97% 1197-18-8 5G 標(biāo)準(zhǔn)品

羅猴胎腎細(xì)胞;MA104拂米龍醋醋酯 FluoroMqtholonq ccqtctq3801-6-7

PROCR Others Cynomolgus 食蟹猴 Epcr / PROCR 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) STREPTAVIDIN鏈霉親合素生物技術(shù)級1MG9013-20-1Frozen

CL-0229T84(人結(jié)腸腺癌肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞)5×106cells/瓶×2硅酮 QF-1NA
耶氏肺孢子蟲試劑盒熒光PCR法大鼠少突膠質(zhì)前體細(xì)胞ROPC二氫鏈雷素，英文名或英文縮寫：Dixy7nostreptomycin sesquisulfate，級別：分析標(biāo)準(zhǔn)品，規(guī)格：1KU

MMP9 Others Rat 大鼠 MMP-9 / CLG4B 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 啊拉伯樹膠 crcbic gum9000-1-2

HELF 人胚肺成纖維細(xì)胞wo7iumAZIDE疊鈉白色結(jié)晶粉末RT sigma

CM-R059大鼠膀胱平滑肌細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL4-(4-nitnopxenylazo)-1-naphthol4-(對硝基本偶氮)-1-奈酚5克高，50%

HGC-27人胃癌細(xì)胞(三號膽鹽)