通過(guò)活體胚胎電穿孔進(jìn)行CRISPR介導(dǎo)小腦顆粒細(xì)胞功能喪失研究

腦畸形是指在懷孕期間大腦沒(méi)有完全形成，并與一些神經(jīng)和發(fā)育問(wèn)題有關(guān)。這種畸形通常是由基因突變引起的，破譯參與正常大腦發(fā)育的關(guān)鍵基因有助于識(shí)別導(dǎo)致大腦疾病和腫瘤形成的潛在因素。為了幫助識(shí)別小腦的體細(xì)胞突變，研究人員利用基因工程小鼠模型，結(jié)合電穿孔的基因傳遞和CRISPR/Cas9技術(shù)，開發(fā)了一種新的方法來(lái)研究一些基因在小腦發(fā)育過(guò)程中的作用。簡(jiǎn)單地說(shuō)，通過(guò)**活體電穿孔，將攜帶向?qū)NA(sgRNA)和Cre的單個(gè)質(zhì)粒導(dǎo)入Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP(條件性敲入)小鼠的小腦干細(xì)胞/前體細(xì)胞中。這種方法能夠成功地標(biāo)記顆粒神經(jīng)元前體細(xì)胞，并允許跟蹤其子代(子細(xì)胞)在產(chǎn)后大腦發(fā)育過(guò)程。

                              外顆粒細(xì)胞層中表達(dá)gfp的細(xì)胞可以觀察到以ki67標(biāo)記的增殖，將表達(dá)對(duì)照sgRNA的

                               質(zhì)粒pU6-sgRNA-Cbh-Cre 通過(guò)活體電穿孔導(dǎo)入到E13.5的Rosa26-CAG-LSLCas9-P2A-EGFP

                              小鼠胚胎中，對(duì)P7小腦進(jìn)行GFP,Ki67和p27的免疫染色。DAPI(藍(lán)色)對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。

ECM 830 & GEMINI 活體胚胎電穿孔Protocol

細(xì)胞: CRISPR – sgRNA 質(zhì)粒導(dǎo)入小腦顆粒細(xì)胞，

應(yīng)用: E13. 5小鼠活體胚胎電穿孔

電極：5 mm 直徑鉑金鑷子電極 # 45-0489

準(zhǔn)備向?qū)NA (sgRNA) 和cre重組酶質(zhì)粒，終濃度至少1ug/ul，準(zhǔn)備fast green染料（終濃度0.05%）。將fast green染料溶于蒸餾水制成1%濃度染料，通過(guò)0.22μm濾膜去除染料顆粒。準(zhǔn)備一個(gè)拉針儀(內(nèi)徑:0.6 - -0.8毫米)制作玻璃毛細(xì)管微量吸液管，每個(gè)小鼠（~12胚胎）注射~15ul質(zhì)粒染料混合液，并立即進(jìn)行手術(shù)。異氟烷麻醉孕13天的孕鼠，暴露**，穿透背部后腦將大約1μl fast green混合的質(zhì)粒注射到第四腦室中，使用鉑金鑷子施加方波脈沖。

方波電穿孔設(shè)置:

電壓: 32 V

脈沖時(shí)間: 50 ms

脈沖個(gè)數(shù): 5

脈沖間隔時(shí)間: 950 ms

電穿孔步驟:

樣本體積 : ~15 ul質(zhì)粒和fast green混合液/小鼠 (~ 12 胚胎)

電極: 將電極橫向放置，負(fù)極覆蓋耳朵，正極置于**壁上方小腦原基

電脈沖 : 點(diǎn)擊Go 或 Start 按鍵，啟動(dòng)自動(dòng)充電和脈沖序列

電擊后處理 : 刺激結(jié)束后迅速將**移回母鼠腹腔，縫合 腹膜和皮膚，進(jìn)行麻醉復(fù)蘇，細(xì)心飼養(yǎng)。

參考文獻(xiàn):

Feng, W., Herbst, L., Lichter, P., Pfister, S. M., Liu, H. K.,Kawauchi, D. CRISPR-mediated Loss of Function Analysis in Cerebellar Granule Cells Using In Utero Electroporation-based Gene Transfer. J. Vis. Exp. (136), e57311, doi:10.3791/57311 (2018).