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靶向沉默ITGB4對TLR4通路的影響（信裕生物文獻）

靶向沉默ITGB4對TLR4通路的影響

王亞琦
中南大學(xué)

摘要：**(asthma)是以AHR、上皮結(jié)構(gòu)性損傷、氣道慢性炎癥等為臨床表型和病理特征的呼吸系統(tǒng)常見**,表現(xiàn)為呼吸道對一般性理化刺激或**、內(nèi)源性**或炎癥介質(zhì)等過度反應(yīng),對病原微生物及毒性氣體的抵抗力降低,易發(fā)生氣道阻力增高和反復(fù),**的發(fā)病機制目前仍不清楚,公認的有**反應(yīng)失平衡和過敏原學(xué)說、神經(jīng)源性氣道炎癥理論及氣道上皮缺陷等。早期的研究顯示,**病人氣道上皮的病理改變與**的局部**炎癥反應(yīng),氣道重構(gòu)及糖皮質(zhì)**的**效果等密切相關(guān)。歐洲呼吸病雜志(Journal of European Respiration)多次明確將**歸類于一類氣道上皮性**。《全球支氣管**防治倡議》(Global Initiative for Asthma,GINA)明確指出,支氣管上皮功能**在**發(fā)病機理中的作用和Ig E介導(dǎo)的機制同等重要,應(yīng)予關(guān)住。本室前期研究應(yīng)用基因芯片篩選了人外周血白細胞差異表達的粘附分子,發(fā)現(xiàn)integrin04在**病人中表達下調(diào)。Toll樣受體1是單個的跨膜非催化蛋白,是天然**與獲得性**的橋梁,參與急性炎癥與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),TLRs可以識別多種微生物源的分子,即病原體相關(guān)分子模式,通過誘導(dǎo)編碼細胞因子基因,如TNF-α和IFN-β轉(zhuǎn)錄而激活炎癥。其中,TLR4具有普遍適用性。本課題組前期實驗證明了integrin β4在**病人的氣道粘膜表達降低,同時發(fā)現(xiàn)沉默integrin β4影響了HBECs的抗原提呈過程,使得上皮細胞激活Thl通路受到抑制。我們猜想integrin β4沉默可能影響Toll樣受體在氣道上皮的表達,從而進一步與氣道局部的**失平衡密切相關(guān)。因此,本課題將主要研究integrin β4沉默對HBECs中TLR4表達及TLR4下游兩條重要信號通路的影響。目的：觀察integrin β4沉默對HBECs中TLR4表達的影響,及TLR4下游兩條重要信號通路的影響。同時,研究integrin β4對誘導(dǎo)**細胞分化的作用,以及由此引起**失平衡,從而對引起**發(fā)病的**學(xué)理論進行初步的探討。方法：(1)設(shè)計并合成integrin β4siRNA,并將其瞬時轉(zhuǎn)染入HBECs中。通過熒光顯微鏡觀察siRNA的轉(zhuǎn)染效率,RT-PCR和流式細胞術(shù)分別從RNA和蛋白水平檢測integrin β4的表達。(2)MTT法確定LPS的*佳給藥濃度。(3)流式細胞術(shù)檢測,在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組TLR4的改變。(4) Western blot法檢測,在LPS作用下,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組MyD88, TRIF的改變,反映integrin β4分別對TLR4下游分子的影響。(5)ELISA法檢測,在LPS分別作用24h,48h,72h后,正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組中TNF-α, IFN-β的改變,進一步檢測integrin β4分別對TLR4兩條信號通路的影響。(6)正常HBECs組,Control siRNA組,integrin β4siRNA組,分別受LPS刺激6h,與**細胞共培養(yǎng)72h,收集細胞上清液,ELISA法檢測IFN-γ, IL-4,IL-17分泌量,觀察integrin β4對誘導(dǎo)**細胞分化的影響。結(jié)果：(1)成功合成integrin β4siRNA,并轉(zhuǎn)染]HBECs。熒光顯微鏡下觀察,siRNA的轉(zhuǎn)染效率為90%。與Control siRNA組相比,轉(zhuǎn)染integrin β4siRNA的HBECs中,integrin β4在mRNA水平及蛋白水平表達均顯著下降(2)LPS作用HBECs的*佳給藥濃度為1μg/mL。(3)LPS刺激使得HBECs中TLR4的表達顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TLR4的表達升高更明顯。(4)LPS刺激使HBECs中MyD88, TRIF的表達顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,MyD88, TRIF的增加趨勢更明顯。(5)LPS刺激使HBECs中TNF-α和IFN-β的表達顯著升高。與Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組在LPS作用下,TNF-α和IFN-β的增加更明顯。與**細胞共培養(yǎng)24h,48h,72h TNF-α的分泌量變化不明顯,然而IFN-β的分泌量在24h,48h升高不明顯,72h時明顯增高。(6)較正常HBECs組和Control siRNA組相比,integrin β4siRNA組可以明顯升高與之共培養(yǎng)的CD4+T細胞對IL-4,IL-17的分泌,對IFN-γ的分泌量無明顯變化。在LPS作用下,LPS組較LPS陰性組相比,IFN-γ的分泌量明顯升高,IL-4和IL-17的分泌量無明顯差異。結(jié)論：(1)通過RNA干擾技術(shù)能有效沉默integrin β4,成功構(gòu)建integrin β4細胞模型。(2)靶向沉默integrin β4可以明顯促進TLR4的表達,激活TLR4下游兩條信號通路,同時對MyD88依賴信號通路激活發(fā)24h,對MyD88非依賴信號通路激活發(fā)生在72h。(3)靶向沉默integrin β4促進CD4+T**細胞向Th2方向分化,平衡向Th2方向漂移,同時,誘導(dǎo)Th17型炎癥發(fā)生。LPS在給藥濃度為1μg/mL時,可以誘導(dǎo)Thl型**發(fā)生。

關(guān)鍵詞：**; 支氣管上皮細胞; 整合素β4; TOll樣受體4;

導(dǎo)師：秦曉群; 劉持;

分類號：R562.25

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