操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產(chǎn)品特點：

1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產(chǎn)品組成:

使用方法:

一:培養(yǎng)細胞預處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細胞預處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。

13. 重復上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
Toxoplasma gondii RFLP基因分析試劑盒20次Preston 選擇性添加物人甲酰甲硫氨酸（fMet）ELISA試劑盒,

Trypanosoma congolense RFLP基因分析試劑盒20次CCDA基礎人尿游離皮質(zhì)醇（UFC）ELISA試劑盒,

Hepatitis B virus RFLP基因分析試劑盒20次彎曲菌血瓊脂基礎人血清素/血清（ST）ELISA試劑盒,

Human cytomegalovirus （HCMV）RFLP基因分析試劑盒20次Campy-Cefex瓊脂基礎人胸腺肽（Thymosin）ELISA試劑盒,

human herpesviruses RFLP基因分析試劑盒20次Campy-Cefex瓊脂基礎人高敏甲狀腺素（u-T4）ELISA試劑盒,

C. albicans RFLP基因分析試劑盒20次MRS 肉湯（MRS）人TU3A蛋白（TU3A）ELISA試劑盒,

C. glabrata RFLP基因分析試劑盒20次MRS 瓊脂（MRSA）人角化因子（KAF）/雙調(diào)蛋白（AR）ELISA試劑盒,

C. tropicalis RFLP基因分析試劑盒20次改良克氏雙糖鐵瓊脂小鼠可溶性CD30（sCD30）ELISA試劑盒,

C. krusei RFLP基因分析試劑盒20次Pfizer 腸球菌選擇性瓊脂小鼠內(nèi)皮素1（ET-1）ELISA試劑盒,

C. guilliermondii RFLP基因分析試劑盒20次Todd-Hewitt 肉湯大鼠葉酸（FA）ELISA試劑盒,

C. parapsilosis RFLP基因分析試劑盒20次牛心湯培養(yǎng)基大鼠醛固酮（ALD）ELISA試劑盒,

Cr. Neoformans RFLP基因分析試劑盒20次BBL瓊脂培養(yǎng)基基礎兔子間粘附分子2（ICAM-2/CD102）ELISA試劑盒,

A. fumigatus RFLP基因分析試劑盒20次BL瓊脂培養(yǎng)基布氏瓊脂   用于彎曲桿菌分離（SN標準）- 布氏瓊脂

F. solani RFLP基因分析試劑盒20次MFC培養(yǎng)基L-異亮氨酸甲酯鹽酸鹽

Helicobacter pylori RFLP基因分析試劑盒20次改良胰蛋白胨大豆肉湯（mTSB）Apiosylskimmin Apiosylskimmin
肺炎鏈球菌（SP）/肺炎雙球菌檢測試劑盒(熒光-PCR法)ADA(Human adenosine deaminase) ELISA Kit  人腺苷脫氨酶氯化鉺(III),六水 99.5% metals basis

HAase(Human Hyaluronidase) ELISA Kit  人透明質(zhì)酸酶氮化鉭  5 μm,99.5% metals basis

AST(Human Aspartate aminotransferase) ELISA Kit  人天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶右旋香芹酮 97%

ACP(Human Acid Phosphatase) ELISA Kit  人酸性磷酸酶N-乙酰-DL-色氨酸 98%

GPI(Human glucose-6-phosphate isomerase) ELISA Kit  人葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸 97%

PGM(Human Phosphoglucomutase) ELISA Kit  人磷酸葡萄糖變位酶N-乙酰甘氨酸 99%

LAP(Human Leucine aminopepridase) ELISA Kit  人亮氨酰氨基肽酶β-氨酸甲酯鹽酸鹽 99%

SK(Human Streptokinase) ELISA Kit  人鏈激酶CBZ-L-天門冬氨酸β-芐酯 98%

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