操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測(cè)定各孔的OD值。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡(jiǎn)單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動(dòng)物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產(chǎn)品組成:

使用方法:

一:培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細(xì)胞預(yù)處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動(dòng)物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動(dòng)物組織,因?yàn)閮瞿^程中形成的冰晶會(huì)將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預(yù)處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細(xì)胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細(xì)胞兩次,得到的白細(xì)胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動(dòng)物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級(jí))四:mtDNA提取

5.在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要?jiǎng)×艺袷帯?/span>

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大,有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會(huì)揮發(fā)。

13. 重復(fù)上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會(huì)影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng),如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個(gè)動(dòng)物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機(jī)械斷裂,電泳時(shí)DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
（種系）體外卵母細(xì)胞成熟（in vitro maturation；IVM）培養(yǎng)液100毫升大鼠間充質(zhì)干-骨髓瓊脂糖凝膠4B

卵母細(xì)胞凍存試劑盒50次小鼠垂體瓊脂糖凝膠6B

卵母細(xì)胞清理液100毫升小鼠腦膜人癌胚抗原（CEA/CD66）ELISA試劑盒,CEA/CD66 ELISA kit

（種系）體外卵母細(xì)胞成熟（in vitro maturation；IVM）1毫升小鼠腦脊神經(jīng)元人狀腺原氨酸（T3）ELISA試劑盒,T3 ELISA

培養(yǎng)生長因子（20倍）小鼠黑質(zhì)神經(jīng)元人Rho家族GTP酶1（RND1）ELISA試劑盒,RND1 ELISA

卵母細(xì)胞核成熟苔紅素（orcein）熒光染色分析試劑盒20次小鼠紋狀體神經(jīng)元人脫氧尿三磷酸（DUTP）ELISA試劑盒,

體外受精（in vitro fertilization IVF）細(xì)胞培養(yǎng)液50毫升小鼠海馬趾神經(jīng)元人抗弓形體IgM抗體（anti-tox IgM）ELISA試劑盒,

胚胎組織培養(yǎng)液500毫升小鼠皮質(zhì)神經(jīng)元人前白蛋白（PA）ELISA試劑盒,

精子活力熒光染色試劑盒50次小鼠顆粒人補(bǔ)體蛋白3（C3）ELISA試劑盒,

精子活力伊紅苯胺黑（eosin－nigrosin）染色試劑盒50次小鼠腹脊髓神經(jīng)元人凝血酶受體（TR）ELISA試劑盒,

精子活力和頂體反應(yīng)三色（triple staining）染色試劑盒50次小鼠背脊髓神經(jīng)元小鼠IgG ELISA試劑盒,

精子頂體形態(tài)花生凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PNA-FITC）染色試劑盒20次小鼠少突膠質(zhì)前體小鼠骨形成蛋白6（BMP-6）ELISA試劑盒,

精子頂體形態(tài)豌豆凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（PSA-FITC）染色試劑盒20次小鼠雪旺小鼠白介素3（IL-3）ELISA試劑盒,

精子頂體形態(tài)刀豆素A凝集素?zé)晒鈽?biāo)記（ConA-FITC）染色試劑盒20次小鼠周神經(jīng)成纖維小鼠磷脂酰肌醇抗體IgG/IgM（PI Ab-IgG/IgM）ELISA試劑盒,

精子活力和頂體形態(tài)雙重?zé)晒馊旧噭┖?/span>20次小鼠星形膠質(zhì)小鼠Ⅰ型前膠原羧基端肽（PⅠCP）ELISA試劑盒,
豬藍(lán)耳病毒天津株（TJM-F92）疫苗檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR法）VEGF(Human Vascular Endothelial cell Growth Factor) ELISA KIT  人血管內(nèi)皮生長因子亞油酸鈉 95%

VCAM-1/CD106(Human Vascuolar cell adhesion molecule 1) ELISA kit  人血管內(nèi)皮粘附分子1海帶多糖  ≥96%(HPLC)

sTRAIL(Human soluble tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand) ELISA KIT  人可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體甲基烯酸月桂酯 96%

TRAIL-R4(Human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand 4) ELISA Kit  人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體4二十酸甲酯 98% (GC)

TRAIL-R3(Human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand 3) ELISA Kit  人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體3蓖麻油酸甲酯 75.0% (GC)

TRAIL-R1(Human tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand 1) ELISA Kit  人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體1甲基環(huán)戊烷 98%

TNF- Beta(Human Tumor necrosis factor Beta) ELISA KIT  人腫瘤壞死因子β2-甲氧基-5-磺酰苯甲酸甲酯 98%

TNF- Alpha(Human Tumor necrosis factor Alpha) ELISA KIT  人腫瘤壞死因子α反-8-甲基-6-壬酰氯 97%

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