操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個動物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產(chǎn)品組成:

使用方法:

一:培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細(xì)胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細(xì)胞預(yù)處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因?yàn)閮瞿^程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預(yù)處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細(xì)胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細(xì)胞兩次,得到的白細(xì)胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。

13. 重復(fù)上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng),如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機(jī)械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
/酵母細(xì)胞線粒體粗提分離試劑盒10次人；Hela S3 [HeLaS3]S-羧甲基-L-半胱氨酸

/酵母細(xì)胞活性線粒體分離試劑盒10次人胰腺腺泡上皮癌；HPACO-苯并三氮唑-N

/酵母細(xì)胞高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒10次人T白血病；HuT 78二氫麻醉椒苦素 Dihidromethysticin

純化線粒體蛋白質(zhì)濃度定量測定試劑盒20次人肺鱗癌；NCI-H520人血管**素4（ANG-4）ELISA試劑盒,

動物血小板線粒體粗提分離試劑盒10次人前列腺癌高轉(zhuǎn)移株；PC-3M IE8小鼠Ⅰ型膠原N末端肽（NTX）ELISA試劑盒,

動物血小板活性線粒體分離試劑盒10次人前列腺癌低轉(zhuǎn)移株；PC-3M-2B4小鼠抗內(nèi)皮抗體（AECA）ELISA試劑盒,

動物血小板高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒10次人肺巨癌高轉(zhuǎn)移株；PG-BE1小鼠心肌營養(yǎng)素1（CT-1）ELISA試劑盒,

動物全血線粒體粗提分離試劑盒10次人肺巨癌低轉(zhuǎn)移株；PG-LH7大鼠白介素27（IL-27）ELISA試劑盒,

動物全血活性線粒體分離試劑盒10次人結(jié)直腸腺癌；SW620 [SW 620；SW-620]心納素（ANF）ELISA試劑盒--動物，人

動物全血高質(zhì)純化線粒體分離試劑盒10次人腦星形膠質(zhì)母瘤；U-87 MG [U87MG；U87 MG]基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子2（TIMP-2）ELISA試劑盒--動物，人

純化線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒20次人肺癌；A-427 [A427]Ⅱ型膠原螺旋肽（HELIX-Ⅱ）ELISA試劑盒--動物，人

動物硬組織線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒20次人胰腺癌；AsPC-1輪狀?。≧V）IgM ELISA試劑盒--動物，人

動物軟組織線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒20次人侵襲性脈絡(luò)膜黑色素瘤；C918戊型肝炎病IgM（HEV-IgM）ELISA試劑盒--動物，人

動物細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒20次人髓母瘤；Daoy改良BPLS瓊脂

/酵母細(xì)胞線粒體可溶性總蛋白制備試劑盒20次人導(dǎo)管癌；HCC38吖啶黃素每支添加于225ml HB4150、HB4192中（SN、GB標(biāo)準(zhǔn)）
禽腺病毒C種4型(FADV-C-4)檢測試劑盒（熒光-PCR法）P-selectin  人可溶性P-選擇素30×100mm G型號

COX-2(human)  人前列腺素氧化環(huán)化酶225×100mm HF254型號

PDGF-AB  人血小板衍生生長因子薄層層析硅膠板 25×100mm GF254型號 70片/盒

PDGF-BB  人血小板衍生生長因子-BB25×100mm H型號

PGE1  人前列腺素1薄層層析硅膠板 25×100mm G型號 70片/盒

PGE2  人前列腺素250×200mm GF型號

P53  人P53蛋白50×200mm HF型號

Osteocalcin  人骨鈣素異丁酰乙酸乙酯 98%

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