操作流程:

1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；

3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

產(chǎn)品特點：

1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。

2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。

3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。

注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。

產(chǎn)品組成:

使用方法:

一:培養(yǎng)細胞預(yù)處理

1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。

2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。

二:組織細胞預(yù)處理

3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。

三:血液預(yù)處理

4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。

5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。

柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取

5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。

6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。

7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。

8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。

9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。

10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。

11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。

12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。

注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。

13. 重復(fù)上步1次。

14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。

15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。

16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。

17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。

18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。

19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
動物軟骨組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次Sars結(jié)構(gòu)蛋白表達株；293 001AⅢ型前膠原肽（PⅢNP）ELISA試劑盒--動物，人

動物直腸組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次Sars結(jié)構(gòu)蛋白表達株；293 001B沙眼衣原體抗體（CT）ELISA試劑盒--動物，人

動物內(nèi)皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次Sars結(jié)構(gòu)蛋白表達株；293sars181A小鼠血管內(nèi)皮生長因子受體2（VEGFR-2/Flk-1）ELISA試劑盒,

動物上皮細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人晶體上皮永生系；SRA01/04（HLE）小鼠膜聯(lián)蛋白Ⅴ（ANX-Ⅴ）ELISA試劑盒,

動物眼組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人胚腎；293FT小鼠丙酮酸激酶（PK）ELISA試劑盒,

動物心臟組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人整合SV40基因的上皮；HBL-100 [HBL100]小鼠過氧化物酶體增殖因子活化受體γ（ PPAR-γ）ELISA試劑盒,

動物小腸組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人胚腎-F克?。?93F小鼠對氨基苯甲酸（PABA）ELISA試劑盒,

動物腎臟組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次SV40T轉(zhuǎn)化人臍靜脈內(nèi)皮；PUMC-HUVEC-T1小鼠低密度脂蛋白復(fù)合物（LDL-IC）ELISA試劑盒,

動物肝組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人EB病轉(zhuǎn)化的B；CGM1小鼠脫氧吡啶酚/脫氧吡啶啉（DPD）ELISA試劑盒,

動物肺組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人整合SV40基因的上皮；HBL-100 [HBL100]肝脂酶（HL）ELISA試劑盒--動物，人

動物結(jié)組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次腺病轉(zhuǎn)化的人胚腎；AAV-293抗單核抗體（AMA）ELISA試劑盒--動物，人

動物乳腺組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次SV40轉(zhuǎn)染人成骨；hFOB 1.19糖皮質(zhì)受體β（GR-β）ELISA試劑盒--動物，人

動物肌肉組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次SV40T轉(zhuǎn)化的人胚腎；293TL-色氨酸甲酯鹽酸鹽

動物神經(jīng)組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人胚腎；293 Cells, low passage小鼠趨化因子（Lptn/LTN/XCL1）ELISA試劑盒,

動物胰腺組織細胞分離培養(yǎng)試劑盒10次人正常前列腺基質(zhì)永生化；WPMY-1小鼠α羥基丁酸脫氫酶（αHBDH）ELISA試劑盒,
禽白血病病毒J型(ALV-J)檢測試劑盒(熒光-PCR法)sTNF Alpha－RI(humen)  人可溶性腫瘤壞死因子-受體11-萘乙酸 分析標準品

cAMP Human  人環(huán)磷酸腺苷1-萘乙酸（NAA)  for plant cell culture, ≥96%

sCD 40L Human  人可溶性表面分化抗原40配體反-玉米素 98%

cGMP Human  人環(huán)磷酸鳥苷溴苯 99.5%

6Ckine /CCL21/SLC Human  人組織趨化性因子對溴甲苯 CP

ENA human  人上皮誘導(dǎo)中型粘活化因子苯 CP, ≥99%

ENA-78 human  人趨化因子 ENA-78溴素 AR，99.5%

eNOS human  人內(nèi)皮型一氧化氮合成酶環(huán)己烷 AR，99.5%

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