熒光定量PCR（qPCR/Real-time PCR）與普通PCR（終點PCR）在原理、技術(shù)特點、應(yīng)用場景等方面存在顯著差異，以下是具體對比：

一、原理與檢測機制

1、?普通PCR

采用終點法檢測，通過高溫變性、退火、延伸循環(huán)擴增DNA片段，反應(yīng)結(jié)束后需通過電泳分析產(chǎn)物（如瓊脂糖凝膠電泳）進行定性或半定量判斷。

無法實時監(jiān)測擴增過程，僅能通過條帶亮度粗略估計產(chǎn)物量，受擴增效率影響較大。

2、?熒光定量PCR

通過熒光染料（如SYBR Green）或探針（如TaqMan）實時監(jiān)測擴增過程中的熒光信號，結(jié)合Ct值（熒光閾值循環(huán)數(shù)）和標(biāo)準(zhǔn)曲線實現(xiàn)**定量。

可動態(tài)追蹤擴增全過程，靈敏度高（可檢測單拷貝），且閉管操作降低污染風(fēng)險。

二、關(guān)鍵技術(shù)差異

1. 分析能力

熒光定量PCR：

定性+定量：既能判斷目標(biāo)序列是否存在（定性），也能**計算初始模板濃度（**定量）或相對表達量（相對定量）。依賴擴增曲線和熔解曲線，可驗證產(chǎn)物特異性（如單一峰表示無引物二聚體或非特異性擴增）。

普通PCR：

僅定性：只能判斷目標(biāo)序列是否存在（條帶有無），無法確定初始模板量。結(jié)果受擴增效率、電泳條件等影響，準(zhǔn)確性較低。

2. 產(chǎn)物長度

熒光定量PCR：適用于 100-300 bp 的短片段，*佳范圍為 80-150 bp，以保證擴增效率和熒光信號靈敏度。普通PCR：可擴增 150 bp至數(shù)千bp 的長片段，具體長度根據(jù)實驗需求調(diào)整。

3.引物設(shè)計要求

4.儀器與成本

熒光定量PCR儀：集成熒光檢測和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，價格和維護成本更高。

普通PCR儀：僅具備溫控功能，儀器價格和檢測成本較低。

三、操作簡便性

熒光定量PCR：操作更為簡便，通過計算機和分析軟件實現(xiàn)PCR擴增、產(chǎn)物檢測和定量分析一體化，結(jié)果觀測重復(fù)性好，避免了人為因素的干擾。

普通PCR：需要在擴增后進行凝膠電泳分析，操作相對復(fù)雜，且結(jié)果的解讀依賴于條帶的亮度和位置。

四、關(guān)鍵參數(shù)差異

?熒光定量PCR?：依賴Ct值（與起始模板量成反比）、擴增曲線及溶解曲線（染料法）。

?普通PCR?：僅通過電泳條帶位置和亮度判斷產(chǎn)物大小及濃度。?

五、靈敏度和特異性

熒光定量PCR：結(jié)合了DNA雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精準(zhǔn)性，能夠檢測單個細(xì)胞的基因，具有更高的靈敏度和特異性。

普通PCR：雖然也能檢測到目標(biāo)序列，但其靈敏度和特異性相對較低。

六、應(yīng)用范圍

普通PCR：適用于基因克隆、病原體初篩等定性分析。

熒光定量PCR：不**于定性分析，還可以進行基因表達的相對和**定量，適用于病毒載量檢測、基因表達差異分析等。

綜上所述，熒光定量PCR憑借實時監(jiān)測和**定量能力，在科研和臨床診斷中更具優(yōu)勢，但成本較高且依賴短片段擴增；普通PCR則適用于低成本、長片段擴增的定性分析。選擇時需根據(jù)實驗?zāi)康模ǘㄐ?/span>/定量）、片段長度和預(yù)算綜合判斷。?