熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）是一種在DNA擴(kuò)增過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)變化的生物技術(shù)。它通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光染料或熒光標(biāo)記探針，實(shí)時(shí)跟蹤PCR產(chǎn)物的**。熒光定量PCR的準(zhǔn)確性可能會(huì)受到多種因素的影響，包括但不限于：

1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

引物設(shè)計(jì)：引物必須與目標(biāo)序列具有高度特異性，以避免非特異性擴(kuò)增。設(shè)計(jì)不當(dāng)?shù)囊锟赡軙?huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的目標(biāo)識(shí)別或形成引物二聚體，這都會(huì)降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

模板質(zhì)量：模板DNA或RNA的純度和完整性對(duì)PCR效率至關(guān)重要。污染或者降解的模板可能導(dǎo)致擴(kuò)增失敗或結(jié)果不可靠。

2、試劑與設(shè)備?

試劑盒靈敏度和特異性差異直接影響結(jié)果。?

儀器控溫精度（如邊緣效應(yīng)）、CCD/PMT性能及校準(zhǔn)狀態(tài)均會(huì)引入誤差?。

3、酶的種類與濃度

需要使用適量的Taq DNA聚合酶，濃度過高可能導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，而過低則會(huì)減少產(chǎn)物量。

4、操作規(guī)范?：包括加樣精度、污染控制（如手套更換）及移液器清潔度，操作失誤易引發(fā)假陽(yáng)性/陰性。?

5、?交叉污染?：實(shí)驗(yàn)環(huán)境中殘留的DNA氣溶膠或試劑污染是假陽(yáng)性的主要來源。

6、 反應(yīng)條件

反應(yīng)體系：包括酶、dNTPs、緩沖液、熒光染料或探針的選擇和配比。優(yōu)化的反應(yīng)體系有助于提高擴(kuò)增效率和特異性。

PCR條件：如變性、退火和延伸的溫度及時(shí)間參數(shù)需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化。

7、 質(zhì)量控制措施

內(nèi)參基因：使用內(nèi)參基因進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，可以減少由于樣品量變化帶來的變異，確保結(jié)果更加可靠。

陰陽(yáng)性對(duì)照：每次實(shí)驗(yàn)都應(yīng)該包含陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，用于監(jiān)控整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中的污染情況和反應(yīng)條件是否正常。

8、循環(huán)次數(shù)：過多的循環(huán)次數(shù)可能引入非特異性產(chǎn)物，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。

9、dNTP的濃度：dNTP的濃度要平衡，過高會(huì)與Mg2+結(jié)合，降低游離Mg2+的濃度，影響酶活性。

10、擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率過低（<90%）或過高（>110%）可能表明引物設(shè)計(jì)不佳、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋錯(cuò)誤或存在抑制劑等問題。

綜上所述，為了確保熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，研究人員需要綜合考慮上述各個(gè)方面，并采取相應(yīng)的質(zhì)量控制措施。熒光定量PCR廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究、分子生物學(xué)研究、臨床診斷、病原體檢測(cè)、基因表達(dá)分析等領(lǐng)域，是現(xiàn)代生物科學(xué)研究和應(yīng)用中不可或缺的技術(shù)。?