“一個陽性細(xì)胞，對應(yīng)一個ELISPOT斑點”，這是ELISPOT檢測的理論前提。無數(shù)的實驗也證明了這一點?，F(xiàn)有的抗體技術(shù)以及酶聯(lián)放大技術(shù)確實可以把單個細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的行為記錄下來，ELISPOT板上的每一個斑點就是*好的證明。下面我們來看一看ELISPOT斑點的特征。
圓形，有暈核結(jié)構(gòu)
這是判定真假ELISPOT斑點的主要標(biāo)準(zhǔn)。ELISPOT斑點有
這種結(jié)構(gòu)可以從幾何學(xué)的原理得到很好的理解和解釋（如圖
1.2所示）。懸浮在ELISPOT板膜上的細(xì)胞，它分泌細(xì)胞因子
是沒有方向性的，均勻地向四面八方擴散，如果擴散到
ELISPOT板膜，就會被板膜上的包被抗體捕獲。在所有從細(xì)胞到斑膜的路徑中，有條路徑*短，這就是位于細(xì)胞正下方到板膜的垂直距離。路徑越短，擴散中耗散損失就越少，到達(dá)該點的細(xì)胞因子就越多，將來顯色的時候顏色就越深。以垂直距離點為圓心，向外畫一系列的同心圓，同心圓的直徑越大，細(xì)胞因子擴散的距離就越長，耗散越多，到達(dá)的細(xì)胞因子就越少，顏色就越淺。當(dāng)超過一定距離之后，擴散到達(dá)的細(xì)胞因子就減少到背景水平了，這就是斑點的邊界。
大小不均一，正態(tài)分布
ELISPOT斑點要比產(chǎn)生它的那個細(xì)胞大很多。我們知道，
哺乳動物細(xì)胞的直徑約是5-10μm，而ELISPOT斑點的直徑通常是50-150μm，比細(xì)胞大10倍以上。
同一類陽性細(xì)胞，受到相同的刺激，產(chǎn)生的斑點大小也不完全相同。這些斑點大小不一，但是如果把它們的直徑統(tǒng)計出來，這發(fā)現(xiàn)它們呈正態(tài)分布的，見圖1.3。
需要說明的是，不同的細(xì)胞，對不同的刺激物，不同的細(xì)胞因子，ELISPOT斑點的直徑（平均直徑）也不同。通常來說，T細(xì)胞產(chǎn)生的斑點較大，單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的斑點??；特異性的抗原（多肽或者蛋白）刺激產(chǎn)生的斑點大，非特異性的有絲分裂原（PHA、ConA等）刺激產(chǎn)生的斑點??；IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的斑點大，IL-10、IL-12、Granzyme B之類的細(xì)胞因子的斑點小。
如果一次實驗中有兩類細(xì)胞同時受到刺激，比如T細(xì)胞與巨噬細(xì)胞，或者一次實驗中T細(xì)胞受到兩種不同的刺激物刺激，比如蛋白抗原與內(nèi)**（大腸桿菌表達(dá)的蛋白很可能含有較高濃度的內(nèi)**），那么同一個孔中就會出現(xiàn)兩種不同的斑點。這兩種斑點用肉眼很難區(qū)別，但是如果對它們直徑分布做統(tǒng)計作圖的話，就會有別于圖1.3中的單峰分布，而是呈現(xiàn)雙峰分布。
