生物物理學(xué)家Joerg Bewersdorf說，2006年是熒光顯微鏡學(xué)的奇跡之年。而與之相媲美的另一個年份是1905年，當(dāng)時愛因斯坦以相對論、量子論和原子物理學(xué)變革了物理領(lǐng)域。而這場顯微鏡學(xué)**，則是由3篇論文組成的，科學(xué)家**能窺見細(xì)胞內(nèi)部并追蹤單個分子的行為。
“每個分子是一臺機(jī)器，一臺納米機(jī)器。”Bewersdorf說。其中，蛋白質(zhì)是尤為復(fù)雜的分子，它們以多種方式彎曲纏繞，執(zhí)行細(xì)胞新陳代謝和生長需要的反應(yīng)。“我們感興趣的是，這些微型機(jī)器是如何整合在一起完成細(xì)胞機(jī)能的？”
長期以來，光學(xué)顯微成像技術(shù)的發(fā)展一直受制于一個物理極限值的約束，也就是德國物理學(xué)家、顯微技術(shù)專家恩斯特·阿貝在1873年提出的預(yù)言：光學(xué)顯微鏡的成像效果被認(rèn)為受到光的波長限制，無法突破0.2微米，即光波長1/2的分辨率極限，此后被稱為“阿貝分辨率”。
在能夠窺見細(xì)胞內(nèi)部之前，科學(xué)家對該問題并沒有清晰的答案。光學(xué)顯微鏡無法提供任何幫助，超越一定放大率后，衍射使得光線四散而非集中于一點。任何距離小于200納米或?qū)挾仁羌?xì)胞膜40倍的物體都會變成一個模糊點。使用電子顯微鏡制作的圖片能分辨精細(xì)結(jié)構(gòu)，但必須是靜態(tài)的，無法用于活細(xì)胞。
2006年，3個實驗室各自采用相似策略克服了“衍射障礙”：利用專業(yè)的熒光探針分析樣本。這些探針能被有選擇地開啟，直到所有探針能在一系列圖像中被捕捉到?？茖W(xué)家能像印象派畫家利用顏色點構(gòu)建一個場景那樣將這些圖像制作成一張圖片。這3個技術(shù)——光敏定位顯微鏡（PALM）、熒光PALM（FPALM）和隨機(jī)光學(xué)重建顯微鏡（STORM），能區(qū)分出相距20納米的目標(biāo)，產(chǎn)生單分子尺度的熒光照片。這些技術(shù)為研究人員插上前進(jìn)的翅膀。例如，Bewersdorf在美國耶魯大學(xué)的實驗室正為活動在活細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)“照相”。
自2006年到現(xiàn)在的10年間，這3個技術(shù)掀起了技術(shù)和方法的革新浪潮。2014年，德國馬克斯普朗克學(xué)會生物物理化學(xué)研究所的Stefan Hell、美國霍華德·修斯醫(yī)學(xué)院珍妮莉婭法姆研究院的Eric Betzig和美國斯坦福大學(xué)的William Moerner提出的打破衍射極限的成像策略使他們成為諾貝爾化學(xué)獎得主。研究人員目前正在制造更明亮的熒光探針，以便照亮未曾展現(xiàn)在人們面前的細(xì)胞進(jìn)程。
“令人興奮的是，這些技術(shù)讓觀察活細(xì)胞成為可能?！闭淠堇驄I法姆研究學(xué)院Jennifer Lippincott-Schwartz說，“目前，使用熒光探針拍攝單個蛋白質(zhì)時機(jī)已經(jīng)成熟?！?/span>
更持久、更明亮
這3個超分辨率顯微鏡技術(shù)都是依靠綠色熒光蛋白質(zhì)（GFP）等化合物發(fā)出光線的。這些物質(zhì)的基因能**入編碼細(xì)胞蛋白質(zhì)的基因中。然后，生成的蛋白質(zhì)中則附著著熒光物質(zhì)，并通過發(fā)出熒光顯示其存在位置。
但這些技術(shù)均存在限制。一個大問題是，在被刺激其發(fā)光的激光徹底損壞前，這些探針只能發(fā)出極為有限的光。甚至在光褪色效應(yīng)發(fā)生前，探針的光已經(jīng)非常微弱了。
而這些探針的綜合版本有機(jī)染料，能發(fā)出更明亮的光，但卻無法編碼目標(biāo)基因，并插入細(xì)胞內(nèi)部。相反，它們通常與能找到蛋白質(zhì)的抗體結(jié)合在一起。但這種組合使得探針過大，無法穿過細(xì)胞膜或干擾蛋白質(zhì)功能?！斑@些探針確實存在限制?！盉ewersdorf說。
幸運(yùn)的是，革新正在出現(xiàn)。Bewersdorf團(tuán)隊正在與兩個團(tuán)隊合作研究可點擊化學(xué)探針：新英格蘭生物實驗室的SNAP-tag和普洛麥格生物技術(shù)公司的HaloTag。這些技術(shù)包含一種能被編碼到興趣蛋白質(zhì)中的較短的靶序列和一個能通過簡單化學(xué)反應(yīng)嵌入靶蛋白中的染色分子。Bewersdorf和同事已經(jīng)證明這兩種技術(shù)能使用有機(jī)染料作用于活細(xì)胞。
另外，研究人員還求助于量子點——納米級半導(dǎo)體。這種物質(zhì)不僅明亮且持續(xù)一個月甚至更久，還能與生物分子相連接。新墨西哥大學(xué)生物物理學(xué)家Diane Lidke在細(xì)胞傳導(dǎo)實驗中就使用了量子點。但量子點存在一個缺點：體積過大。市場上能買到的量子點都有一個殼，這讓其直徑大了15~25納米。與只有4納米寬的熒光蛋白質(zhì)相比，“它們太大太笨重了”。
這一缺點意味著研究人員很難將量子點放入細(xì)胞或其他緊密空間中，但能有效應(yīng)用于在細(xì)胞外基質(zhì)和膜結(jié)合蛋白中。在與其丈夫、該校物理學(xué)家Keith Lidke的合作中，Lidke開發(fā)出了多色、快速、單分子追蹤技術(shù)，能用量子點在定制顯微鏡中生產(chǎn)圖片。
打開細(xì)胞
穿越細(xì)胞膜是熒光顯微鏡面臨的*大障礙之一?！凹幢阒挥?納米厚，細(xì)胞膜已經(jīng)進(jìn)化了數(shù)十億年，以便隔離細(xì)胞內(nèi)外，而且，效果出奇地好?！币晾Z伊大學(xué)香檳分校生物物理學(xué)家Paul Selvin說。
Selvin的實驗室開發(fā)出的量子點更小，直徑接近9納米??這一尺寸能讓他將量子點滑過神經(jīng)細(xì)胞之間20~40納米的空隙，信息傳導(dǎo)分子經(jīng)由這里向相鄰神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息。一旦進(jìn)入這里，量子點能束縛并突出幫助記憶形成的受體的存在。雖然Selvin并沒有將這些量子點植入活細(xì)胞內(nèi)，但他認(rèn)為這是可行的。
該實驗室還計劃在細(xì)胞膜上穿孔，然后迅速密封起來，以避免破壞細(xì)胞。“我們能夠使用一種名為鏈球菌溶血素的**酶在細(xì)胞膜上鉆一個約5納米的微小孔洞?！盨elvin說。這一寬度足以讓熒光蛋白質(zhì)通過，甚至是聯(lián)合了抗體的蛋白質(zhì)，以便尋找細(xì)胞內(nèi)部的目標(biāo)物體。之后，研究人員能利用尚未發(fā)表的方法在20分鐘內(nèi)修補(bǔ)這些孔洞。
另外，還有人擔(dān)憂，這些探針會干擾靶蛋白的功能。而約翰斯·霍普金斯大學(xué)生物物理學(xué)家Jie Xiao則提出了一個不會損傷這些蛋白質(zhì)的替代方案。
她的探針分子經(jīng)過基因修飾，并非附著在目標(biāo)分子上，它們被制作出來后，就立刻被一種酶劈開，并進(jìn)入細(xì)胞膜的一個特定位置。這就意味著它們不再攜帶靶分子的位置信息，但卻位于能對其進(jìn)行**計算的位置，并由此獲得蛋白質(zhì)產(chǎn)生的**計數(shù)，同時，蛋白質(zhì)本身能自由發(fā)揮功能。Xiao將該技術(shù)稱為裂解共轉(zhuǎn)化活化（CoTrAC）。
“量化活細(xì)胞的蛋白質(zhì)水平非常重要。”Xiao解釋道，“人們通常使用熒光指示出相對變化?！钡溲芯康幕蛘{(diào)控蛋白質(zhì)極少，很難用超分辨計數(shù)成像。此外，這些蛋白質(zhì)的**數(shù)字的細(xì)微變化也能判斷細(xì)胞狀態(tài)改變與否。
讓背景暗下去
除了更明亮，另一個讓探針脫穎而出的方法是降低背景亮度。德國波恩大學(xué)生物物理化學(xué)家Ulrich Kubitscheck表示，“細(xì)胞中也有擴(kuò)散的背景?！狈前械鞍咨踔帘旧砭陀刑烊?、暗淡的熒光，這就造成了背景噪音。如果減少背景噪音，圖像的清晰度就會提高。
因此，研究人員不斷改進(jìn)亮度策略。Kubitscheck實驗室使用激光層照顯微技術(shù)生產(chǎn)一個非常細(xì)的**聚焦光束，該光束能從側(cè)面穿過樣本?！拔覀兘ㄔ炝艘恍┫虏亢退闹芡该鞯牟Ａ?。”他說。通過從側(cè)面而非頂部向樣本照射光線，該團(tuán)隊照亮了一個200~300納米厚的切片，并從下部對樣本進(jìn)行觀察?？茖W(xué)家利用這種方法，看到RNA分子經(jīng)過一種名為核膜孔的蛋白質(zhì)絡(luò)合物輸出，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。在這里，它們開始指揮蛋白質(zhì)合成。
能進(jìn)行激光層成像的顯微鏡已經(jīng)商業(yè)化。具備專業(yè)知識的研究團(tuán)隊已經(jīng)組成，并開始定制自己的顯微鏡。
而下一代選擇性平面照明顯微術(shù)被稱為晶格光片顯微鏡，誕生自Betzig的實驗室。項目合作者、珍妮莉婭法姆研究院細(xì)胞生物學(xué)家Zhe Liu說，該技術(shù)能產(chǎn)生300~500納米厚的照明平面，其優(yōu)點在于光點的結(jié)構(gòu)。晶格能形成一個三維網(wǎng)格，照亮樣本的連續(xù)剖面。
總之，顯微鏡技術(shù)在生物學(xué)發(fā)展歷程中至關(guān)重要，尤其是早期顯微術(shù)領(lǐng)域的某些重要發(fā)現(xiàn)，直接促成了細(xì)胞生物學(xué)及其相關(guān)學(xué)科的突破性發(fā)展。隨著生命科學(xué)的研究由整個物種發(fā)展到分子水平，顯微鏡的空間分辨率及鑒別精微細(xì)節(jié)的能力已經(jīng)成為關(guān)鍵技術(shù)問題。光學(xué)顯微鏡的發(fā)展史就是人類不斷挑戰(zhàn)分辨率極限的歷史。
