SCI醫(yī)學論文- transwell細胞遷移實驗步驟
實驗外包- transwell細胞遷移實驗步驟
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1材料準備：
可拍照顯微鏡，Transwell小室，孔徑8μm，沒包被膠的(Coster和Corning公司的也較常用)，Transwell遷移實驗的細胞培養(yǎng)板24孔板。細胞培養(yǎng)板應(yīng)當與購買的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，無血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培養(yǎng)基，DMEM完全培養(yǎng)基，1640完全培養(yǎng)基（也可加到20%血清），無菌PBS，棉簽，胰酶（0.25?TA胰酶），4%多聚甲醛固定液或者甲醇，結(jié)晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS結(jié)晶紫）
2步驟和流程
2.1基質(zhì)膠鋪板：
用BD公司的Matrigel 1：8（根據(jù)細胞產(chǎn)生mmp的量來決定）稀釋，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝膠。使用前進行基底膜水化。
2.2制備細胞懸液
①制備細胞懸液前可先讓細胞撤血清饑餓12－24h，進一步去除血清的影響。但這一步并不是必須的。
②消化細胞，終止消化后離心棄去培養(yǎng)液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的無血清（或者1?S）培養(yǎng)基重懸。調(diào)整細胞密度至5×105/ml。
2.3接種細胞
①取細胞懸液100µl加入Transwell小室。
② 24孔板下室一般加入600µl含20?S的培養(yǎng)基，特別注意的是，下層培養(yǎng)液和小室間常會有氣泡產(chǎn)生，一旦產(chǎn)生氣泡，下層培養(yǎng)液的趨化作用就減弱甚至消失了，在種板的時候要特別留心，一旦出現(xiàn)氣泡，要將小室提起，去除氣泡，再將小室放進培養(yǎng)板。
③培養(yǎng)細胞：常規(guī)培養(yǎng)12－48h（主要依癌細胞侵襲能力而定）。24h較常見，時間點的選擇除了要考慮到細胞細胞侵襲力外，處理因素對細胞數(shù)目的影響也不可忽視。
2.4結(jié)果統(tǒng)計
直接計數(shù)法，“貼壁”細胞計數(shù)，這里所謂的“貼壁”是指細胞穿過膜后，可以附著在膜的下室側(cè)而不會掉到下室里面去，通過給細胞染色，可在鏡下計數(shù)細胞。
取出Transwell小室，棄去孔中培養(yǎng)液，用無鈣的PBS洗2遍，甲醇固定30分鐘，將小室適當風干。
0.1%結(jié)晶紫染色20 min，用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞，用PBS洗3遍。
400倍顯微鏡下隨即五個視野觀察細胞，記數(shù)。
transwell細胞遷移實驗步驟
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