SCI論文翻譯- TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)注意事項(xiàng)
實(shí)驗(yàn)外包- TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)注意事項(xiàng)
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1）石蠟包埋的組織切片預(yù)處理：將組織切片置于染色缸中,用二甲苯洗兩次,每次5min.用無水乙醇洗兩次,每次3min.用95％和75％乙醇各洗一次,每次3min.用PBS洗5min 加入蛋白酶K溶液（20ug／ml）,于室溫水解15min,去除組織蛋白.用蒸餾水洗4次,每次2min,然后按下述步驟2進(jìn)行操作.
（2）冰凍組織切片預(yù)處理：將冰凍組織切片置10％中性甲醛中,于室溫固定10min后,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min.置乙醇：乙酸（2：1）的溶液中,于-20℃處理5min,去除多余液體.用PBS洗兩次,每次5min,然后按下述步驟2進(jìn)行操作.
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)注意事項(xiàng)
出現(xiàn)非特異性熒光標(biāo)記
a. 有些細(xì)胞或組織，例如平滑肌細(xì)胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導(dǎo)致出現(xiàn)非特異性的熒光標(biāo)記。解決方法是，取細(xì)胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導(dǎo)致假陽性。
b. 使用了不適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ海缫恍┧嵝怨潭ㄒ?，?dǎo)致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測(cè)反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)，或TUNEL檢測(cè)反應(yīng)過程中反應(yīng)液滲漏，細(xì)胞或組織表面不能保持濕潤(rùn)，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應(yīng)時(shí)間，并確保TUNEL檢測(cè)反應(yīng)液能很好地覆蓋樣品。
熒光背景很高
a. 支原體污染。請(qǐng)使用支原體染色檢測(cè)試劑盒檢測(cè)是否為支原體污染。
b. 高速分裂和增殖的細(xì)胞，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應(yīng)過強(qiáng)。可以用試劑盒提供的TdT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當(dāng)日使用。
d. 紅細(xì)胞中血紅蛋白導(dǎo)致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴(yán)重干擾。此時(shí)宜選擇其它細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒。
標(biāo)記效率低
a. 使用乙醇或甲醇固定會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的效率較低。
b. 固定時(shí)間過長(zhǎng)，導(dǎo)致交聯(lián)程度過高。此時(shí)宜減少固定時(shí)間。
c. 熒光淬滅。Fluorescence在普通光照10分鐘就會(huì)嚴(yán)重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時(shí)，如果碘化丙啶染色過深會(huì)導(dǎo)致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
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