酵母雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用中常遇到的問題一是假陽性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽性就是:在待研究的兩個蛋白間沒有發(fā)生相互作用的情況下,報告基因被激活。主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨激活作用,或者這種融合蛋白的激活作用被外來蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合,則也可單獨激活報告基因的表達。因此,為排除假陽性就需要作嚴(yán)格的對照試驗。應(yīng)對誘餌和靶蛋白分別作單獨激活報告基因的鑒定。目前幾個公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個報告基因,且每個報告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同,這可減少大量的假陽性。另外,報告基因通常整合到染色體上,可以使基因表達水平穩(wěn)定,消除了由于質(zhì)?？截悢?shù)變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。即使根據(jù)嚴(yán)格的對照實驗證明確實發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對以下方面進行分析：

 (1)這種相互作用是否會在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生,即這一對蛋白在細(xì)胞的正常生命活動中是否會在同一時間表達且定位在同一區(qū)域。

 （2)某些蛋白如是依賴于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員,它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。

 （3)一些實際上沒有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來,酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽性方面不斷改進,并且已取得較好的效果〔2，3〕。

 在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時也會遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用,但報告基因不表達或表達程度甚低以至于檢測不出來〔4〕。造成假陰性的原因主要有兩 方面：一是融合蛋白的表達對細(xì)胞有毒性。這時應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。二是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實驗中的主要問題,但也應(yīng)予以重視。

 轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫篩選時成敗的關(guān)鍵之一，特別是對低豐度cDNA庫進行篩選時，必須提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時省力。更重要的是如果單獨轉(zhuǎn)化會發(fā)生融合表達蛋白對酵母細(xì)胞的毒性時,共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中,通過兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個二倍體細(xì)胞。

 目前很多機構(gòu)建立了大量的cDNA文庫和基因組文庫，但這些文庫大多無法直接用于雙雜交系統(tǒng)的篩選。而文庫的質(zhì)量對于轉(zhuǎn)化和篩選又非常關(guān)鍵。因此，大量構(gòu)建適用于酵母雙雜交的文庫非常必要。現(xiàn)已出現(xiàn)一種采用體內(nèi)重組技術(shù)來達到這個目的的方法〔5〕。

 

4 酵母雙雜交技術(shù)的新發(fā)展

 

 酵母雙雜交技術(shù)在應(yīng)用中發(fā)揮了巨大的作用，但人們也注意到了它有一定的局限性。為此發(fā)展了多種適應(yīng)不同目的需要的改型的雙雜交技術(shù)。

 反向雙雜交技術(shù) 在研究中檢測并鑒定出那些能阻斷兩個蛋白間相互作用的因素有重要意義。在研究那些能使相互作用被阻斷的因素(如尋找哪些結(jié)構(gòu)域上發(fā)生突變可使相互作用中斷或那些分子可以阻斷相互作用)時，傳統(tǒng)的雙雜交技術(shù)有較大的局限性。因此，反向雙雜交系統(tǒng)(Reverse Two-Hybrid System)應(yīng)運而生〔6，7〕。這項技術(shù)的特點是采取了反選擇篩選策略。根據(jù)反選擇設(shè)計的不同，大致可以分為兩類。一類是用便于反選擇的URA3或CYH2基因作為報告基因。URA3基因編碼尿嘧啶合成途徑中的重要酶：乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶，它能把5’-氟乳清酸（5’-FOA）轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)胞毒性物質(zhì)， 使細(xì)胞無法生長。反之，在能生長的細(xì)胞中，外界因素已使蛋白間的相互作用不能發(fā)生，而我們想知道的正是這些因素。因此，只要對存活的克隆進行檢測就可以得到結(jié)果。 Vidal等人用這種技術(shù)發(fā)現(xiàn)了影響轉(zhuǎn)錄因子E2F1中與DP1相互作用必需區(qū)內(nèi)的點突變〔9〕。另一類是將常規(guī)報告基因(如HIS3)置于大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn10編碼的tet-抑制因子(TetR)/操縱基因控制之下。待測蛋白之間發(fā)生相互作用后首先激活tet-R基因表達抑制因子TetR,TetR結(jié)合到tet操縱基因后就抑制了報告基因的表達，結(jié)果轉(zhuǎn)化子不能生長。只有當(dāng)待測蛋白之間的相互作用被某種因素所阻斷而無法激活tet-R基因時，報告基因才能擺脫tet操縱基因的控制而表達，使轉(zhuǎn)化子獲得在選擇培養(yǎng)基上生長的能力。Shih 等人利用這種方法鑒定出cAMP-應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)中磷酸化位點的Ser133突變會阻斷其與輔助激活因子(CREB結(jié)合蛋白)的相互作用〔8〕。

 三雜交技術(shù) 在許多細(xì)胞內(nèi)信號傳遞過程中，兩個蛋白間的相互作用常涉及到其它的大分子。如蛋白，激酶，RNA,多肽及其它大分子。在研究這些大分子對蛋白間相互作用的影響過程中發(fā)展了一種新的技術(shù)系統(tǒng)——三雜交系統(tǒng)(Three-Hybrid System)，其本質(zhì)與雙雜交是相同的，只是需通過第三個分子的介導(dǎo)把兩個雜交蛋白帶到一起〔9〕。例如小配體三雜交系統(tǒng)(Small Ligand Three-Hybrid System)是利用可以滲透的二聚體化學(xué)誘導(dǎo)物(Chemical Inducers of Dimerization,CIDs)作橋梁，將AD和BD融合蛋白連接到一起，激活報道基因的表達。研究較多的是**抑制劑FK506〔10〕。Belshaw等將FK506與環(huán)孢菌素A(Cyclosporin A)構(gòu)建成異源二聚體，它能把分別與FK506和環(huán)孢菌素A有相互作用的AD和BD融合蛋白拉倒一起，激活報告基因〔11〕。Licitra將FK506與地米塞松(dexamethasone )通過共價鍵連接成二聚體。通過實驗進一步證實了FK506與蛋白FKBP-12間的特異性相互作用〔12〕，表明用這種方法鑒定蛋白與小分子間的相互作用是切實可行的。RNA與蛋白之間的相互作用是許多細(xì)胞生命活動的基礎(chǔ)，例如mRNA的翻譯，早期發(fā)育以及RNA病毒的感染等。然而可用于這方面研究的簡便方法卻很少。RNA三雜交系統(tǒng)(RNA Three-Hybrid System)的建立為分析RNA與蛋白之間的相互作用提供了有效的手段。這個系統(tǒng)主要是由一個RNA分子和兩個都能結(jié)合該RNA的蛋白質(zhì)組成。此RNA的一部分與一個已知蛋白結(jié)合后就可利用它的另一部分去篩選新的RNA結(jié)合蛋白。因此這種技術(shù)既可檢測由RNA介導(dǎo)的兩個蛋白質(zhì)之間的相互作用，也可篩選鑒定新的蛋白結(jié)合RNA。Putz等把HIV-1病毒Rev蛋白的突變體RevM10與Gal4 DB域融合作為誘餌蛋白，利用該RevM10蛋白能識別并結(jié)合其靶RNA中Rev蛋白反應(yīng)元件(Rev responsive element,RRE)的作用去篩選同樣也能與此RNA結(jié)合并已與Gal4 AD域融合的未知蛋白。根據(jù)同樣的原理，如將一個已知RNA與RRE融合形成雜合RNA分子并配以RevM10-Gal4 DB融合蛋白作為誘餌，便可用于篩選該RNA結(jié)合蛋白的cDNA克隆〔13〕。SenGupta 等利用RNA噬菌體衣殼蛋白能識別結(jié)合其基因組內(nèi)一種21核苷酸的RNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特性，將RNA噬菌體衣殼蛋白與Lex DB域融合，構(gòu)建成可用于尋找體內(nèi)的RNA結(jié)合蛋白的酵母三雜交系統(tǒng)〔14〕。

 核外雙雜交技術(shù) 在傳統(tǒng)的酵母雙雜交系統(tǒng)中，蛋白之間的相互作用是在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性，近年來有人建立了核外雙雜交技術(shù)。其中SRS 和USPS就是這種技術(shù)的兩個代表。SRS也稱Sos蛋白召集系統(tǒng)(Sos Recruitment System)。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動物細(xì)胞的一種鳥苷交換因子(EGF)Sos蛋白融合；將Y蛋白與錨定在酵母細(xì)胞膜上的Src肉豆寇烯化信號蛋白融合，并使它們共表達于一個cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內(nèi)。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的EGF蛋白在36℃條件下不能激活細(xì)胞膜上的Ras蛋白，Ras途徑不通。所以細(xì)胞無法在36℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發(fā)生相互作用就能把Sos蛋白帶到細(xì)胞膜上并激活附近的Ras蛋白，從而打通Ras途徑，使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。Aronheim等用此技術(shù)鑒別出了一些新的c-Jun相互作用蛋白，并分離到了一個AP-1抑制因子JDP2〔15〕。USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器(Ubiquitin-based Split Protein Sensor)。它的設(shè)計是根據(jù)這樣一個事實，即真核細(xì)胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs)迅速切開，但這種切割只有當(dāng)遍在蛋白正確折疊時才會發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離，只要共表達與同一個細(xì)胞內(nèi)，它們?nèi)阅苷_折疊。將待測蛋白X與帶有點突變的遍在蛋白N端片段融合，將待測蛋白Y與下游接有報告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合，并使它們共表達與同一個細(xì)胞內(nèi)。因遍在蛋白N端片段內(nèi)含有點突變，它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當(dāng)?shù)鞍譞和Y之間發(fā)生相互作用時才能克服點突變的影響，使遍在蛋白的兩端形成正確折疊，從而引來UBPs切除與C端片段連接的報告蛋白。此技術(shù)建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發(fā)生了相互作用的，所以操作比較繁瑣，不便于推廣〔16〕。*近有人對它作了改進，以一種融合的轉(zhuǎn)錄激活因子PLV作為報告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下，它就會進入細(xì)胞核內(nèi)激活特定的報告基因，如：LacZ 和HIS3等。這樣就可以根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟，提高了篩選效率〔17〕。

 

 

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