SCI論文發(fā)表-EMSA實(shí)驗(yàn)步驟
上海拜沃生物科技有限公司提供代做實(shí)驗(yàn)、文庫構(gòu)建、課題設(shè)計(jì)、整體實(shí)驗(yàn)外包、中文核心期刊、SCI論文發(fā)表等服務(wù)，詳情請咨詢。
凝膠遷移或電泳遷移率實(shí)驗(yàn)（EMSA）是一種研究DNA結(jié)合蛋白和其相關(guān)的DNA結(jié)合序列相互作用的技術(shù)，可用于定性和定量分析。這一技術(shù)*初用于研究DNA結(jié)合蛋白，目前已用于研究RNA結(jié)合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。
通常將純化的蛋白和細(xì)胞粗提液和32P同位素標(biāo)記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復(fù)合物和非結(jié)合的探針。DNA-復(fù)合物或RNA-復(fù)合物比非結(jié)合的探針移動(dòng)得慢。同位素標(biāo)記的探針依研究的結(jié)合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當(dāng)檢測如轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子一類的DNA結(jié)合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細(xì)胞抽提液。在檢測RNA結(jié)合蛋白時(shí)，依據(jù)目的RNA結(jié)合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質(zhì)細(xì)胞抽提液。競爭實(shí)驗(yàn)中采用含蛋白結(jié)合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特異），和其它非相關(guān)的片段（非特異），來確定DNA或RNA結(jié)合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據(jù)復(fù)合物的特點(diǎn)和強(qiáng)度來確定特異結(jié)合。
1. 探針的標(biāo)記-EMSA實(shí)驗(yàn)步驟
探針為含有與蛋白特異結(jié)合的中心盒，大約20 bp左右，使用pierce公司的3’末端標(biāo)記試劑盒(PIERCE，Rockford，IL，USA)標(biāo)記。操作步驟參照說明書，具體步驟如下：
1) 將試劑盒中除TdT以外的其他組分解凍并置于冰上。迅速稀釋TdT：Sx TdT Reaction Buffer 2 u1，超純水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀釋后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul)，稀釋后的TdT必須現(xiàn)配現(xiàn)用，稀釋后不能保存。
2) 反應(yīng)體系：5x TdT buffer 10 ul，DNA 5 pmol，Biotin-ll-UTP 5 ul，diluted TdT5 ul，超純水補(bǔ)足50 ul。在37℃溫浴3 0 min，加入2/5體積0.2 M EDTA，終止反應(yīng)。加入等體積氯仿：異戊醇(24：1)抽提TdT，渦懸充分，高速離心3 min，取上層即為標(biāo)記探針，分裝后-80℃保存。
2. 非變性電泳-EMSA實(shí)驗(yàn)步驟
1) 非變性電泳：30%丙稀酸胺2.66 ml，TBE(5X)2 ml，10%過硫酸按1.4 ml，TEMED7 ul，雙蒸水補(bǔ)足20 ml。按照上述配方配置4%的非變性膠。在燒杯中迅速混勻，置于冰上，灌膠，待凝膠聚合后拔出梳子，用雙蒸水洗點(diǎn)樣孔，再用0.5xTBE清洗點(diǎn)樣孔。
2) 樣品準(zhǔn)備：按照不同的組合加入DNA和蛋白，另外還需要加入結(jié)合緩沖液，如果是粗蛋白還需要加入poly(dI.dC)(試劑盒中有)抑制非特異性條帶的產(chǎn)生。
3) 電泳：預(yù)跑膠30-60 min，100 V。上樣。跑膠，100 V，30 min左右。注意電泳要在冰上完成，以防止電泳時(shí)產(chǎn)生熱量使不穩(wěn)定的復(fù)合物解離。
4) 轉(zhuǎn)膜：電泳跑好后，將膠取下，放在大小相似的尼龍膜上，上下各加一層潤濕的blotting paper，放到半干轉(zhuǎn)移裝置上，100 V，380 mA，轉(zhuǎn)膜1 h。
5) UV交聯(lián)：取出膜。在紫外交聯(lián)儀中999.9 mJ，固定10 min。
6) 洗膜：
a. 將Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。
b. 用20 ml of Blocking Buffer封閉膜，溫浴15 min，搖床輕搖。
c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1：300稀釋)，配置成conjugate/blocking solution。
d. 將膜從blocking buffer中取出，在conjugate/blocking solution中輕搖15 min。
e. 將4XWash Buffer用雙蒸水稀釋成1 Xwash solution。
f. 將膜置于新的培養(yǎng)皿，用20 ml 1 Xwash solution沖洗。
g. 用1 Xwash solution洗膜4次，每次5 min，搖床輕搖。
h.在新培養(yǎng)皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer，將膜放入，溫浴5 min，搖床輕搖。
i. 將6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于錫箔紙包好的燒杯中，搖勻，作為Substrate Working Solution。
j. 將膜從Substrate Equilibration Buffer中取出，用濾紙盡量吸去液體，放入新的培養(yǎng)皿。
k. 將Substrate Working Solution用槍慢慢加到膜上使液體盡量到達(dá)整張膜，靜置5min。
l. 取出膜，控制膜不能干燥。
m. 用保鮮膜將膜包好，不能有氣泡。
n. 在暗室中，將膜放入曝光盒，用X-ray膠片壓片，曝光時(shí)間隨溫度變化而不同，室溫一般1 min。然后將膠片取出，經(jīng)過顯影，水洗和定影可以看到實(shí)驗(yàn)結(jié)果，如果膠片長期保存一定要在水龍頭底下長時(shí)間沖洗，晾干后可拍照。
SCI論文發(fā)表-EMSA實(shí)驗(yàn)步驟
上海拜沃生物科技有限公司提供代做實(shí)驗(yàn)-EMSA實(shí)驗(yàn)服務(wù)。
聯(lián)系方式
電話： 55890177
聯(lián)系人：李波
在線QQ：516260426