酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對(duì)真核細(xì)胞調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程的認(rèn)識(shí)。許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子都是由兩個(gè)可以分開的、功能上相互獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域組成的。例如，酵母的轉(zhuǎn)錄激活因子GAL4，在N端有一個(gè)由147個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合域（DNA binding domain, BD），C端有一個(gè)由113個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄激活域（transcription activation domain, AD）。GAL4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列（upstream activation sequence, UAS）結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。但是，單獨(dú)的DNA結(jié)合域不能激活基因轉(zhuǎn)錄，單獨(dú)的轉(zhuǎn)錄激活域也不能激活UAS的下游基因，它們之間只有通過(guò)某種方式結(jié)合在一起才能具有完整的轉(zhuǎn)錄激活因子的功能。

 

　　酵母雙雜交文庫(kù)可用來(lái)研究已知蛋白間的相互作用、尋找在蛋白與蛋白間相互作用中起到關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)域、尋找與靶蛋白相互作用的新蛋白等。

    研究?jī)?nèi)容

轉(zhuǎn)大腸桿菌：文庫(kù)構(gòu)建完成后進(jìn)行分析鑒定，包括庫(kù)容量、插入片段大小、全長(zhǎng)率、冗余度、Blast結(jié)果等；

轉(zhuǎn)酵母菌：文庫(kù)構(gòu)建完成后進(jìn)行分析鑒定，包括庫(kù)容量、插入片段大小等。

技術(shù)參數(shù)

1、樣本要求

 

        （1）建庫(kù)樣品為組織：請(qǐng)?zhí)峁┳懔康男迈r樣品（4℃保存，不超過(guò)**）或?qū)⑿迈r樣品立即存于液氮或－80℃，保存不超過(guò)一個(gè)月；如為植物樣本，為了降低文庫(kù)中的葉綠體污染，樣品須是黃化苗。

 

          （2）RNA 樣品要求：總RNA＞50 μg，濃度＞0.3 μg/μL；OD260/280值：2.0，以我方電泳膠圖、紫外分析儀定量為準(zhǔn)。RNA的總量根據(jù)庫(kù)容量不同會(huì)有所增加。

 

2、項(xiàng)目執(zhí)行周期

 

          （1）轉(zhuǎn)大腸桿菌的全長(zhǎng)文庫(kù)運(yùn)轉(zhuǎn)周期約為42個(gè)工作日，均一化增加10個(gè)工作日，百萬(wàn)擴(kuò)增加10個(gè)工作日；

 

          （2）轉(zhuǎn)酵母細(xì)胞的全長(zhǎng)文庫(kù)運(yùn)轉(zhuǎn)周期約為45個(gè)工作日，均一化增加10個(gè)工作日。

 

3、完成指標(biāo)及提交結(jié)果

 

（1）轉(zhuǎn)大腸桿菌：

 

文庫(kù)合格標(biāo)準(zhǔn)： 插入片段平均長(zhǎng)度1kb，庫(kù)容大于1×106克隆，空載率<10%；若為均一化C庫(kù)，冗余度小于10％（以兩板的文庫(kù)送檢結(jié)果為準(zhǔn)）；

提交結(jié)果： 初始庫(kù)容大于106轉(zhuǎn)化菌液、測(cè)序文庫(kù)送檢報(bào)告及結(jié)題報(bào)告。

 （2）轉(zhuǎn)酵母菌：

 

文庫(kù)合格標(biāo)準(zhǔn)： 插入片段平均長(zhǎng)度1kb，庫(kù)容大于1×106克隆，空載率<15%；

提交結(jié)果： 初始庫(kù)容大于106轉(zhuǎn)化菌液及結(jié)題報(bào)告。

注：進(jìn)行酵母菌轉(zhuǎn)化無(wú)法通過(guò)測(cè)序進(jìn)行文庫(kù)鑒定，因此，無(wú)全長(zhǎng)率和冗余度標(biāo)準(zhǔn)。

 

 

 

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