醫(yī)學(xué)SCI包發(fā)-實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

上海拜沃生物科技有限公司專業(yè)提供實(shí)驗(yàn)外包-實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)服務(wù)，下面是一些熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)，希望能給各位老師提供幫助。

一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。

3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。

4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理12hr以上。然后用高壓**除去殘留的DEPC。不能高壓**的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22μm濾膜過濾**。

5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實(shí)驗(yàn)過程中手套要勤換。

6. 設(shè)置RNA操作專用實(shí)驗(yàn)室，所有器械等應(yīng)為專用。

二、常用的RNA酶抑制劑

1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。

2. 異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是*有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。

3. 氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。

5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。

因?yàn)?/span>DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA，因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一些緩沖液(例如Tri)不能相容

在所有RNA實(shí)驗(yàn)中，*關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實(shí)驗(yàn)失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。

RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓**等。

研究人員造成的污染 RNA酶*主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時應(yīng)勤換手套。

但DEPC能與胺和巰基反應(yīng),因而 含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理

注意：DEPC有致癌之嫌

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