實驗外包- siRNA的轉(zhuǎn)染方法服務
將制備好的siRNA，siRNA表達載體或表達框架轉(zhuǎn)導至真核細胞 中的方法主要有以下幾種：

1.磷酸鈣共沉淀

將氯化鈣，RNA(或DNA )和磷酸緩沖液混合，沉淀形成包含DNA 且極小的不溶的磷酸鈣顆粒。磷酸鈣-DNA 復合物粘附到細胞 膜并通過胞飲進入目的細胞 的細胞 質(zhì)。沉淀物的大小和質(zhì)量對于磷酸鈣轉(zhuǎn)染的成功至關重要。在實驗中使用的每種試劑都必須小心校準，保證質(zhì)量，因為甚至偏離*優(yōu)條件十分之一個pH都會導致磷酸鈣轉(zhuǎn)染的失敗。

2.電穿孔法

電穿孔通過將細胞 暴露在短暫的高場強電脈沖中轉(zhuǎn)導分子。將細胞 懸浮液置于電場中會誘導沿細胞 膜的電壓差異，據(jù)認為這種電壓差異會導致細胞 膜暫時穿孔。電脈沖和場強的優(yōu)化對于成功的轉(zhuǎn)染非常重要，因為過高的場強和過長的電脈沖時間會不可逆地傷害細胞 膜而裂解細胞 。一般，成功的電穿孔過程都伴隨高水平（50%或更高）的毒性。

3.DEAE-葡聚糖和polybrene

帶正電的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚體復合物和帶負電的DNA 分子使得DNA 可以結(jié)合在細胞 表面。通過使用DMSO或甘油獲得的滲透休克將DNA 復合體導入。兩種試劑都已成功用于轉(zhuǎn)染。DEAE-葡聚糖**于瞬時轉(zhuǎn)染。

4.機械法

轉(zhuǎn)染技術也包括使用機械的方法，比如顯微注射和基因槍（biolistic particle）。顯微注射使用一根細針頭將DNA ，RNA或蛋白直接轉(zhuǎn)入細胞 質(zhì)或細胞 核?；驑屖褂酶邏簃icroprojectile將大分子導入細胞 。

5.陽離子脂質(zhì)體試劑

在優(yōu)化條件下將陽離子脂質(zhì)體試劑加入水中時，其可以形成微小的（平均大小約100-400nm）單層脂質(zhì)體。這些脂質(zhì)體帶正電，可以靠靜電作用結(jié)合到DNA 的磷酸骨架上以及帶負電的細胞 膜表面。因此使用陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理與以前利用中性脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的原理不同。使用陽離子脂質(zhì)體試劑，DNA 并沒有預先包埋在脂質(zhì)體中，而是帶負電的DNA 自動結(jié)合到帶正電的脂質(zhì)體上，形成DNA -陽離子脂質(zhì)體復合物。據(jù)稱，一個約5kb的質(zhì)粒會結(jié)合2-4個脂質(zhì)體。被俘獲的DNA 就會被導入培養(yǎng)的細胞?，F(xiàn)存對DNA 轉(zhuǎn)導原理的證據(jù)來源于內(nèi)吞體和溶酶體。

實驗外包- siRNA的轉(zhuǎn)染方法為了達到高的轉(zhuǎn)染效率，在轉(zhuǎn)染實驗過程中，需要注意以下幾點：

1.純化siRNA

在轉(zhuǎn)染前要確認siRNA的大小和純度。為得到高純度的siRNA，推薦用玻璃纖維結(jié)合，洗脫或通過15-20%丙烯酰胺膠除去反應中多余的核苷酸，小的寡核苷酸，蛋白和鹽離子。注意：化學合成的RNA通常需要跑膠電泳純化（即PAGE膠純化）。

2.避免RNA酶污染

微量的RNA酶將導致siRNA實驗失敗。由于實驗環(huán)境中RNA酶普遍存在，如皮膚，頭發(fā)，所有徒手接觸過的物品或暴露在空氣中的物品等，此保證實驗每個步驟不受RNA酶污染非常重要。

3.健康的 細胞 培養(yǎng)">細胞 培養(yǎng)物和嚴格的操作確保轉(zhuǎn)染的重復性

通常，健康的細胞 轉(zhuǎn)染效率較高。此外，較低的傳代數(shù)能確保每次實驗所用細胞 的穩(wěn)定性。為了優(yōu)化實驗，推薦用50代以下的轉(zhuǎn)染細胞 ，否則細胞 轉(zhuǎn)染效率會隨時間明顯下降。

4.避免使用***

Ambion公司推薦從細胞 種植到轉(zhuǎn)染后72小時期間避免使用***。***會在穿透的細胞 中積累**。有些細胞 和轉(zhuǎn)染試劑在siRNA轉(zhuǎn)染時需要無血清的條件。這種情況下，可同時用正常培養(yǎng)基和無血清培養(yǎng)基做對比實驗，以得到*佳轉(zhuǎn)染效果。

5.選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑

針對siRNA制備方法以及靶細胞 類型的不同，選擇好的轉(zhuǎn)染試劑和優(yōu)化的操作對siRNA實驗的成功至關重要。

6.通過合適的陽性對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件

對大多數(shù)細胞 ，看家基因是較好的陽性對照。將不同濃度的陽性對照的siRNA轉(zhuǎn)入靶細胞 （同樣適合實驗靶siRNA），轉(zhuǎn)染48小時后統(tǒng)計對照蛋白或mRNA相對于未轉(zhuǎn)染細胞 的降低水平。過多的siRNA將導致細胞 毒性以至死亡。

7.通過標記siRNA來優(yōu)化實驗

熒光標記的siRNA能用來分析siRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)染效率。標記的siRNA還可用作siRNA胞內(nèi)定位及雙標記實驗（配合標記抗體）來追蹤轉(zhuǎn)染過程中導入了siRNA的細胞 ，將轉(zhuǎn)染與靶蛋白表達的下調(diào)結(jié)合起來。

 實驗外包- siRNA的轉(zhuǎn)染方法

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