實(shí)驗(yàn)外包- TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法
TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒是采用非同位素方法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞在凋亡過(guò)程中DNA 的斷裂情況，可在原位快速準(zhǔn)確地檢測(cè)單個(gè)凋亡細(xì)胞。本試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）的凋亡原位檢測(cè)。
TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法
對(duì)于貼壁細(xì)胞或細(xì)胞涂片
a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細(xì)胞貼得不牢，可以干燥樣品使細(xì)胞貼得更牢。
c. 用4%多聚甲醛或碧云天生產(chǎn)的**染色固定液(P0098)固定細(xì)胞30-60分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
f. 轉(zhuǎn)步驟5。
對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a. 收集細(xì)胞(不超過(guò)200萬(wàn)細(xì)胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。為防止細(xì)胞聚集成團(tuán)，宜在側(cè)擺搖床或水
平搖床上緩慢搖動(dòng)的同時(shí)進(jìn)行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重懸細(xì)胞，冰浴孵育2分鐘。
e. 轉(zhuǎn)步驟5。
對(duì)于石蠟切片
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無(wú)水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2分鐘。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的*佳作用溫度和時(shí)間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會(huì)嚴(yán)重干擾后續(xù)的標(biāo)記反應(yīng)。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。
對(duì)于冷凍切片
a. 用4%多聚甲醛固定細(xì)胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分鐘。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。
配制TUNEL檢測(cè)液
參考下表配制適當(dāng)量的TUNEL檢測(cè)液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測(cè)液必須一次使用完畢，不能凍存。
1個(gè)樣品 5個(gè)樣品 10個(gè)樣品
TdT酶 2μl 10μl 20μl
熒光標(biāo)記液 48μl 240μl 480μl
TUNEL檢測(cè)液 50μl 250μl 500μl
對(duì)于貼壁細(xì)胞、細(xì)胞涂片或組織切片
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。注意：孵育時(shí)需注意在周?chē)媒闼募埢蛩幟薜缺３譂駶?rùn)，以盡量減少TUNEL檢測(cè)液的蒸發(fā)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍為515-565nm(綠色熒光)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞或細(xì)胞懸液
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測(cè)液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時(shí)可以用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)或涂片后在熒光顯微鏡下觀察?？梢允褂玫募ぐl(fā)波長(zhǎng)范圍為450-500nm，發(fā)射波長(zhǎng)范
圍為515-565nm(綠色熒光)。
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