實驗外包-real-time PCR引物設(shè)計原則
在NCBI找到你要的基因序列，以CDS區(qū)進行引物設(shè)計。
參照以下real-time PCR引物設(shè)計原則：
1.*好位于編碼區(qū)5’端的300-400bp區(qū)域內(nèi)，可以用DNAman,Alignment 軟件看看結(jié)果。
2. 產(chǎn)物不能形成二級結(jié)構(gòu)（自由能小于58.61KJ/mol）。
3.引物長度一般在17-25堿基之間,上下游引物不能相差太大。
4.G+C含量在40%~60%之間，45-55％*佳。
5.堿基要隨機分布，盡量均勻。
6.引物自身不能有連續(xù)4個堿基的互補。
7.引物之間不能有連續(xù)4個堿基的互補。
8.引物5′端可以修飾。
9. 3’端不要以A結(jié)尾，3′端不可修飾，而且要避開AT,GC rich的區(qū)域，避開T/C,A/G連續(xù)結(jié)構(gòu)（2-3個）。
10. 引物3′端要避開密碼子的第3位。
11.引物整體設(shè)計自由能分布5‘端大于3’端，且3‘端自由能*好小于9KJ/mol?？捎胦ligo 6 軟件進行比對看結(jié)果的情況。
12.做熒光定量產(chǎn)物長度80-150bp*好，*長是300bp.
13.引物設(shè)計避免DNA污染，*好跨外顯子接頭區(qū)。
14.引物與非特異性擴增序列的同源性*好小于70％或者有8個互補堿基同源。
15.查看有無假基因的存在。假基因就是無功能的DNA序列，與需要擴增的目的片段長度相似。
16.TM值在55-63度之間。
17. .引物與非特異性擴增序列的同源性*好小于70％或者有8個互補堿基同源。
實驗外包-real-time PCR引物設(shè)計原則
正在著手做real-time PCR的朋友們，我想*開始肯定要考慮引物設(shè)計的問題。
看完下面的文字，我保證你得到想要的引物設(shè)計方法和引物序列。
**步：拿到你所要研究的基因的序列。不要告訴我你不會找序列。如果真的不會，請參考丁香園內(nèi)其他版塊，如NCBI使用，序列查找等。
**步：確定你想用哪種方法。Taqman Probe還是SYBR染料？兩種方法各有利弊，這里不贅述，不明白的依然參見其他版塊。但需要指出的是，后者在國內(nèi)更常用，因為比較簡單，容易操作，容易分析。建議初學(xué)者選擇。
第三步：動手設(shè)計引物了！
1）兩種引物設(shè)計軟件。在設(shè)計real-time PCR引物時，常用的有非常NB的primer premier 5.0和primer express 3.0(升級版有5.0)。前者可以應(yīng)用與常規(guī)PCR和real-time PCR；后者是ABI公司的real-time PCR儀器配套的引物設(shè)計軟件，專門為real-time PCR設(shè)計。
2）選擇哪個軟件合適？在**步中，我已經(jīng)說過，你要先確定你選擇哪個方法。如果你想用Taqman Probe法，請你選擇primer express 3.0。如果你想用SYBR法，我建議你選primer premier 5.0。為什么？請你往下看。
3）兩種引物設(shè)計軟件之比較。先說專門為real-time PCR定制的primer express 3.0。這個軟件其實是為Taqman探針法設(shè)計的，而不適合SYBR染料法。如果你用探針法，強烈推薦。打開軟件就會發(fā)現(xiàn)，在方法選擇的下拉菜單中，都是Taqman探針法，沒有染料法。結(jié)果導(dǎo)致，在你進行引物遴選的時候，都要考慮到“位于上下游引物之間的探針，以及探針與上下游引物的聯(lián)系”！*終把條件限制的很窄。而染料法相對于探針法，條件相對寬泛。*終，你得不到滿意的染料法的引物。在升級版中，是否有解決，我不知道，也沒用過升級版。
由于primer express 3.0的局限性，使得采用染料法的朋友們，不得不求助于primer premier 5.0。具體使用方法可以在論壇里搜索。但是，需要一些遴選條件。見下面的附件。
第四步：如果你比較懶，自己又學(xué)不會用軟件。那么，請你求助有強大的google和百度。搜索模式：A（你所關(guān)注的基因名稱）+B（real-time PCR）google 或A（你所關(guān)注的基因名稱）+C（熒光定量PCR）百度。然后下載那篇文章，找到你要的序列的引物。
第五步：如果沒有人比你更懶，那么，請你在丁香園的引物板塊尋找你的引物是否有人提供到數(shù)據(jù)庫了，如果找不到（相信大部分找不到），那你發(fā)帖求助。
第六步：我把我找到的，驗證比較好的β-antin 熒光定量PCR引物和GAPDH熒光定量PCR引物（SYBR法）分享。大家參考。
實驗外包-real-time PCR引物設(shè)計原則
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