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技術(shù)文章

種子純度檢驗(yàn)方法及種子純度檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展
　近幾年來(lái)，隨著生化分析和分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，農(nóng)作物種子純度檢驗(yàn)方法已由外觀形態(tài)發(fā)展到生理生化水平和分子水平上的鑒正。

一、形態(tài)檢驗(yàn)法

　　形態(tài)學(xué)方法是檢驗(yàn)人員借助放大鏡、解剖鏡等工具，依據(jù)某一作物品種不同于其他品種的特定的外觀形態(tài)特征來(lái)進(jìn)行鑒定的方法。
1．種子形態(tài)檢驗(yàn)法根據(jù)種子形狀、大小、色澤、質(zhì)地、表面的光與毛以及種子外表各部位的特征來(lái)加以鑒別，以區(qū)分本品種與異品種。該法簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、快速，但準(zhǔn)確性較差，且隨著現(xiàn)代育種科學(xué)的發(fā)展，不同品種間種子外觀形態(tài)的差異越來(lái)越小，因此靠區(qū)別種子形態(tài)上的差異來(lái)鑒定種子純度也變得越來(lái)越困難。
2．種苗形態(tài)檢驗(yàn)法該法根據(jù)不同品種幼苗的獨(dú)特性狀進(jìn)行檢驗(yàn)，如幼苗芽鞘顏色、幼苗生長(zhǎng)錐、于葉的形狀、顏色、大小等。該法簡(jiǎn)便、省時(shí)，但受環(huán)境的影響頗大，檢驗(yàn)結(jié)果不夠可靠。
3．田間小區(qū)種植檢驗(yàn)法（成株期形態(tài)檢驗(yàn)法）該法是將一定量的作物種子在田間種植一個(gè)小區(qū)，單粒播種，不間苗，不定苗，并設(shè)有標(biāo)準(zhǔn)品種小區(qū)作對(duì)照，成株期依據(jù)其主要特征鑒定純度，這是*為通用的且比較可靠的方法。主要根據(jù)株形、株高、葉片數(shù)、葉色、葉片寬窄、花藥顏色等作出評(píng)判。但此法所需時(shí)間較長(zhǎng)，當(dāng)年所生產(chǎn)的種子要等下一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)或異地鑒定才能得到結(jié)果，往往喪失商機(jī)，且費(fèi)工占地。而且這種方法受環(huán)境影響頗大，使得鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性受到一定程度的影響。由于形態(tài)學(xué)方法的諸多不足，用一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、實(shí)用的室內(nèi)檢測(cè)方法來(lái)代替形態(tài)法已成必然。將電泳技術(shù)和DNA分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到純度鑒定這一領(lǐng)域，恰恰順應(yīng)了這一要求。

二、蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗(yàn)法

　　蛋白質(zhì)電泳技術(shù)檢驗(yàn)法是指利用電泳技術(shù)對(duì)備檢樣品的種子或幼苗的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、染色，形成蛋白質(zhì)電泳譜帶的差異，并與標(biāo)準(zhǔn)品種相比較，從而鑒定品種的真實(shí)性和純度的一種方法。不同作物品種，基因不同，基因的直接表達(dá)產(chǎn)物——蛋白質(zhì)在種類、數(shù)量、結(jié)構(gòu)等方面亦不同。該法即是利用蛋白質(zhì)的多態(tài)性來(lái)反映不同品種DNA組成上的差異，從而進(jìn)行品種鑒定。該法快速、可靠，不受環(huán)境影響。
1．同工酶電泳法同工酶是指來(lái)源相同，催化相同反應(yīng)而結(jié)構(gòu)不同的酶分子類型，具組織、發(fā)育和品種間特異性。該法是指利用電泳技術(shù)（包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳等）來(lái)分離各種酶的同工酶，通過(guò)比較同工酶諾，來(lái)確定作物種子的純度。目前，在作物種子純度鑒定中，*常用的、多態(tài)性較強(qiáng)的是脂酶和過(guò)氧化物酶，所用方法多為聚丙烯酰胺凝膠電泳法。Quillet等（1992）研究了地理起源不同的52個(gè)向日葵自交系的8個(gè)同工酶系統(tǒng)，表明同時(shí)運(yùn)用8種同工酶系統(tǒng)可鑒定出其中45個(gè)基因型，占總基因型的84％。但與其他方法相比，該法還存在著一些不足：①同工酶具組織、發(fā)育的特異性：不同組織、不同發(fā)育時(shí)期，同工酶的數(shù)量和組成不同。利用同工酶鑒定種子純度所用材料多為幼苗，而將種子萌發(fā)為幼苗不光費(fèi)時(shí)，還往往因?yàn)榉N子在萌發(fā)進(jìn)程上的不一致而導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果偏差較大；⑦譜帶位點(diǎn)與凝膠濃度、提取液配方、電泳程序等有關(guān)；②因酶易失活，故技術(shù)上有一定難度。
2．種子貯藏蛋白電泳法種子中所含的貯藏蛋白質(zhì)可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白等。每一類蛋白質(zhì)的比例因物種而異，但在品種鑒定上多是根據(jù)醇溶蛋白（禾谷類）和球蛋白（豆類）的多樣性。不同蛋白質(zhì)所帶電荷不同，在電場(chǎng)中泳動(dòng)的速度也不同，電泳之后，通過(guò)染色顯示蛋白質(zhì)條帶的數(shù)目、位置和顏色深淺，便構(gòu)成品種的“指紋”特征，可用于品種鑒定。所用電泳技術(shù)包括聚丙烯酰胺凝膠電泳、淀粉膠電泳及等電聚焦電泳等。E11Zs等（1997）利用淀粉凝膠電泳分析了29個(gè)英國(guó)小麥品種的醇溶蛋白，除極個(gè)別外，這些品種都能被區(qū)分開(kāi)。但值得注意的是，對(duì)于某些遺傳組成非常接近的品種，如保持系和不育系，不易找到特異蛋白，采用蛋白質(zhì)電泳難以發(fā)現(xiàn)特征帶。另外，蛋白質(zhì)電泳圖譜易受種子（或幼苗）發(fā)育階段及表達(dá)器官的影響，有時(shí)不夠穩(wěn)定，影響了圖譜分析，從而影響了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。
　　目前，國(guó)外許多先進(jìn)種子檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室多采用超薄等電聚焦電泳法來(lái)進(jìn)行品種鑒定。該法操作方便、準(zhǔn)確性高、制膠速度快。由于凝膠超薄（0．15mm），因而可降低檢驗(yàn)成本，且縮短了固定、染色和脫色時(shí)間。再加上該法采用水平平板電泳槽，可進(jìn)行雙聚焦，這樣就大大增加了點(diǎn)樣數(shù)量，從而提高了工作效率。

三、DNA分子標(biāo)記技術(shù)檢驗(yàn)法
　　品種間形態(tài)和生化上的區(qū)別．歸根到底是 1DR種間在基因（DNA）上的區(qū)別。DNA分子標(biāo)記技術(shù)即是通過(guò)對(duì)品種DNA的多態(tài)性即DNA減基序列的差異進(jìn)行分析，從而鑒別不同品種。其檢測(cè)對(duì)象是種子的DNA片段（基因），沒(méi)有器官的特異性，不受環(huán)境的影響，有較高的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性和重復(fù)性。目前，在作物品種鑒定中應(yīng)用的有RFLP技術(shù)、RAPD技術(shù)、微衛(wèi)星技術(shù)和AFLP技術(shù)等。
1．RFLP技術(shù) RFLP（Restriction Frag— nent Len Polymorphism）是由GrOdztcker〔1974）*早創(chuàng)立的，是分析不同生物個(gè)體間基因細(xì)微差異的可靠方法。它的基本原理是：當(dāng)用限制性內(nèi)切酶切割不同品種的DNA時(shí)，會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)多的數(shù)目和大小不等的DNA片段。對(duì)其進(jìn)行電泳，并利用放射性同位素標(biāo)記的DNA作探針進(jìn)行分子雜交，來(lái)顯示與探針同源的酶切片段在長(zhǎng)度上的多態(tài)性，從而將不同1bn種的種子區(qū)別開(kāi)來(lái)。由于同種作物不同品種間能找到較多RFLP標(biāo)記，利用某一品種特定的RFLP可以準(zhǔn)確地標(biāo)記該品種，因而該項(xiàng)技術(shù)是進(jìn)行品種真實(shí)性及純度鑒定的可靠方法。RFLP多態(tài)性穩(wěn)定、容易重復(fù)，結(jié)果準(zhǔn)確。但該技術(shù)也存在一些不足之處：多態(tài)有限、成本昂貴、費(fèi)時(shí)，同時(shí)放射性同位素的使用會(huì)影響人體**，從而限制了該技術(shù)在實(shí)踐中的應(yīng)用。
2．RAPD技術(shù) RAPD（Randomly AmPli— ied Polymorphic DNA）是由美國(guó)杜邦公司W(wǎng)illiams等人（1990）和加利福尼亞生物研究所Welsh等（1990）領(lǐng)導(dǎo)的兩個(gè)小組同時(shí)發(fā)展起來(lái)的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)利用隨機(jī)合成的寡聚核昔酸序列（9～10個(gè)bp）作為引物，對(duì)所研究的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠電泳上分離，并經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜。在基因組上，每個(gè)引物可以連續(xù)直接擴(kuò)增特定的DNA片段，對(duì)一個(gè)特定的基因型來(lái)講，這些擴(kuò)增的片段或片段的類型是**的，因此用來(lái)鑒定品種純度是很有用的。傅家瑞（1994）曾報(bào)道：從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴(kuò)增DNA片段；中國(guó)科學(xué)院遺傳所陳洪等（1996）利用OPP—18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu)63雜種純度，鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，速度快，費(fèi)用低，既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用，又不受種屬的限制，被廣泛用于多種作物的種子鑒定。RAPD技術(shù)不足之處： ①提供的信息不夠全；②結(jié)果重復(fù)性不好； ⑤RAPD一般為顯性標(biāo)記，不能鑒定雜合子；④提取種子DNA的方法仍較繁瑣。因此，該項(xiàng)技術(shù)在種子純度鑒定中存在有一定的局限性。
3．微衛(wèi)星技術(shù) 真核生物的基因組中散布大量的串聯(lián)重復(fù)序列，其中，2～4個(gè)bp的微衛(wèi)星序列（Micmsatellite或叫簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR：Simple5equenceRepeats）具有高度多態(tài)性（Taubll989，Tautz和Eenz，1984），為DNA指紋分析提供了基礎(chǔ)c微衛(wèi)星在結(jié)構(gòu)上的*大特點(diǎn)是兩端序列較保守，因此可設(shè)計(jì)與兩端保守序列互補(bǔ)的引物進(jìn)行PCE擴(kuò)增，來(lái)揭示微衛(wèi)星的多態(tài)性，從而減少了酶切、制備探針、分子雜交等繁瑣程序。RusBell等（1997）發(fā)現(xiàn)在11個(gè)大麥SSR中，利用4個(gè)SSR組成的3個(gè)不同組合均可以區(qū)分24個(gè)大麥品種，錯(cuò)誤概率僅為千分之一，來(lái)自相同親本的不同基因型也可區(qū)分開(kāi)。與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法和其他品種鑒定技術(shù)相Lb，該技術(shù)多態(tài)性水平高（可用于亞種間鑒定，已在水稻的品種鑒定中得到應(yīng)用），易于分析，不受環(huán)境影響。但該技術(shù)程序復(fù)雜，費(fèi)用較高，盡管在種子純度檢驗(yàn)上具有潛力，但目前尚不能普及。
4．AFLP AFLP（Amplified Fragnent Len— gyhPo1ymorphism）擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性是荷蘭科學(xué)家Zabean等人（1993）發(fā)明的一項(xiàng)**技術(shù)，實(shí)質(zhì)是RFLP和PCR兩項(xiàng)技術(shù)的結(jié)合，具有RFLP的穩(wěn)定性和PCR技術(shù)的高效性。其原理如下：當(dāng)基因組ONA經(jīng)酶切后，會(huì)形成大小不等的隨機(jī)限制性DNA片段，在這些限制性片段的兩端連接上與酶切位點(diǎn)配對(duì)的特定接頭，然后用與接頭互補(bǔ)的專用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增、電泳、放射自顯影顯示DNA指紋。為有選擇地?cái)U(kuò)增某些限制性片段，專用引物在酶切位點(diǎn)序列的3’端還添加1—10個(gè)長(zhǎng)度不等的隨機(jī)脫氧核苷酸，由此可調(diào)節(jié)AFLP產(chǎn)物條帶的特異性和數(shù)量。該技術(shù)避免了分子雜交的復(fù)雜程序，靈敏度高、快速、多態(tài)性強(qiáng)、DNA的用量少、具較好的重復(fù)性。不足之處是操作時(shí)間長(zhǎng)，步驟多，對(duì)實(shí)驗(yàn)技能及儀器設(shè)備的精密度要求很高，加之是**技術(shù)，受**法保護(hù)，所以該法不宜大面積普及推廣。綜上所述，作物種子純度檢驗(yàn)技術(shù)已由傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)方法發(fā)展到分子水平，其方法是由簡(jiǎn)單到復(fù)雜，結(jié)果也更加**。每一種方法都有其自身的優(yōu)缺點(diǎn)，至今還沒(méi)有哪一種方法能夠比較準(zhǔn)確、快速、經(jīng)濟(jì)地進(jìn)行種子純度檢驗(yàn)。與其他方法相比，DNA分子標(biāo)記技術(shù)多態(tài)性豐富、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、無(wú)器官發(fā)育時(shí)期的特異性，不受環(huán)境影響，但所需儀器精密、藥品昂貴，程序復(fù)雜，離普及和應(yīng)用尚有距離。因此，在進(jìn)行具體的種子純度檢測(cè)時(shí)，應(yīng)視具體情況靈活掌握，將傳統(tǒng)的形態(tài)鑒定方法、現(xiàn)代生化方法和分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，充分發(fā)揮綜合技術(shù)優(yōu)勢(shì)，方能達(dá)到準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、快速檢測(cè)的目的。