一．血紅蛋白測定

（一）氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)法 血紅蛋白測定一般使用氰化高鐵血紅蛋白(HiCN)法。
1．操作：取血20µ1，加到5m1HiCN試劑中，充分混合，靜置5分鐘，以HiCN或蒸餾水為空白，用分光光度計波長540nm測吸光度，則測定管血紅蛋白（g/l＝測定管吸光度×367.7）。
2．HiCN試劑的配法：***50mg，高鐵***200mg，無水磷酸二氫鉀140mg，TritonX-100 1.0ml，加蒸餾水至1000m1，此液為淡黃色透明溶液，用蒸餾水調(diào)零，波長540nm的吸光度為零。此液貯存在棕色瓶中，放冰箱保存，一般可保存數(shù)月。
3．注意事項：在使用HiCN法測定血紅蛋白時應(yīng)注意，試劑中的KCN為劇毒藥品，廢液需用除毒液處理。除毒液可用硫酸亞鐵和NaOH 按2：1的比例研碎，配制成100g/L。在每1000ml廢液中加入5ml除毒液攪拌3小時，即可使劇毒的***變成無毒的亞鐵***。
（二）堿羥高鐵血紅素(AHD～575)法
1．操作：取血20µ1加到下述任何一種3m1反應(yīng)液中，充分混合，靜置3分鐘，用反應(yīng)液調(diào)零，用分光光度汁波長575nm處，測定吸光度(A)，則血紅蛋白(g/l)＝測定管吸光度×349.7。
2．反應(yīng)液的配法：
① 配方一： TritonX-100 25g，加0.1molNaOH至1000ml；
② 配方二：皂素1g，加0.1molNaOH至1000ml；
③ 配方三：Brij－35 25g，加0.1molNaOH至1000ml。

二．紅細(xì)胞計數(shù)：

動物紅細(xì)胞計數(shù)可用普通的血細(xì)胞計數(shù)器，也可用光電比濁法。
（一）計數(shù)方法（試管法）
1．用清潔干燥的微量血紅蛋白吸管吸取動物末梢靜脈血20mm3，擦去管**外部的余血。
2．迅速擠入盛有4ml紅細(xì)胞稀釋液的華氏小試管中搖勻，此時血液的稀釋倍數(shù)為1／200。
3．將稀釋液滴入計數(shù)池，靜置3分鐘，在高倍鏡下數(shù)中央大方格中的5個中方格，將5個方格計數(shù)的紅細(xì)胞數(shù)相加。
4．計算：5格的總和×1／50mm3（5個中格的體積）×1／200（稀釋倍數(shù)）＝1／10000mm3。
故5格的總和×10000即為每1／2 mm3 內(nèi)的紅細(xì)胞數(shù)。
（二）紅細(xì)胞稀釋液的配制
1．配方一：
氯化鈉        0.8g
蒸餾水        1000ml
2．配方二：
氯化鈉        9g
重碳酸鈉      1g
蒸餾水夾至      1000ml

三．白細(xì)胞計數(shù)：

（一）計數(shù)方法
與紅細(xì)胞計數(shù)一樣，可用普通的血細(xì)胞計數(shù)器，也可用電子血細(xì)胞計數(shù)機(jī)計數(shù)。
1．用清潔干燥的微量血紅蛋白吸管吸取動物末梢靜脈血20mm3，擦去管**外部的余血。
2．立即擠入盛有0.4ml白細(xì)胞稀釋液的小試管內(nèi)，充分搖勻。
3．將混懸液滴1小滴入計數(shù)池。
4．靜置3分鐘，待白細(xì)胞下沉后，在低倍鏡下數(shù)四角4個大方格的白細(xì)胞數(shù)。
5．計算：4個大方格的體積為4／10mm3，血液稀釋倍數(shù)為20倍。故4格白細(xì)胞數(shù)的總和×4／10×1／20=1／50mm3，4格白細(xì)胞總數(shù)×50=lmm3的白細(xì)胞總數(shù)。
（二）白細(xì)胞稀釋液的配方
冰醋酸(純) 200ml
蒸餾水加至 1 000ml
稀釋液內(nèi)加入少許結(jié)晶紫或美藍(lán)，呈淺紫色，以資識別，并可使白細(xì)胞更明顯。

四．白細(xì)胞分類計數(shù)

（一）計數(shù)方法
1．采血：常法取動物末梢靜脈血滴于載玻片的一端。
2．取1片邊緣光滑平整的玻片作推片，先放血滴前方，兩者成30～35°角，將推片稍向后拉，并左右移動使血滴形成一線，粘著推片邊緣。
3．將推片由1端向另1端平穩(wěn)地推進(jìn)，用力須均勻，直至血液推盡為止。推片角度的大小可控制血片的厚薄，角度大、移動快則血片厚，相反則血片薄。應(yīng)移動稍快不加壓力將血液推成薄膜。
4．將推好的血片置于空氣中完全干燥。一般良好的血片應(yīng)有頭、體、尾3部分，血膜開始端較厚，末端較薄，玻片兩側(cè)及兩端都有適當(dāng)空余部位。
5．染色：將血片需染的部分兩端用蠟或蠟筆畫一線，防止染液流出。把血片放在染色架上或平臺上，滴瑞氏染液5—7滴，蓋滿整個血膜，l min后加等量磷酸緩沖液。在常溫下染色l0min，用水沖洗。將染好的血片直立于空氣中，待鏡檢。
6．計數(shù)：先在低倍鏡下**觀察已染血片，可略知細(xì)胞分布情況、染色好壞，以及對白細(xì)胞總數(shù)作出初步估計。選擇血片厚薄均勻，在血片體、尾部之間，轉(zhuǎn)換油鏡下數(shù)滿100—200個白細(xì)胞。一般白細(xì)???總數(shù)在10 000左右數(shù)100個，10 000以上數(shù)200個。將中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、**細(xì)胞、單核細(xì)胞分別記錄在血細(xì)胞分類計數(shù)器上，求出百分率。
l張染色好的血片，在顯微鏡下紅細(xì)胞呈橘紅色，中央色淡；白細(xì)胞核呈紫紅色，嗜中性粒細(xì)胞呈淺紅紫色或粉紅色；嗜酸性粒細(xì)胞呈亮紅色；嗜堿性粒細(xì)胞呈暗紫色；**細(xì)胞漿呈淺藍(lán)色；單核細(xì)胞漿呈極淺藍(lán)色。
（二）染液和緩沖液的配置
1．染液的配置：
瑞氏染粉 0.1g
中性甘油 3ml
甲醇 60ml
配法：準(zhǔn)確稱取瑞氏染粉，放入潔凈研缽中研細(xì)。加入中性甘油再研，加入少量甲醇再研。將上層溶解的染料倒入棕色瓶中，再加入少量甲醇研磨，如此直至染料全部溶解，加甲醇至需配置容量?；靹蚝笾米厣恐斜４?，用前過濾。一般配置后在常溫下保存一周即可使用。
2．緩沖液配置（pH6.4）：
10％無水磷酸二氫鉀 30ml
10％無水磷酸氫二鈉 20ml
蒸餾水加至 1000ml

五．血小板計數(shù)：

（一）計數(shù)方法
1．小試管內(nèi)加血小板稀釋液0.4ml。取動物靜脈血20mm3，迅速擠于稀釋液內(nèi)，立即充分搖勻。
2．放置4—10min，待溶液呈透明紅色，說明紅細(xì)胞已經(jīng)充分溶解，充分搖勻，取1小滴加入計數(shù)池。
3．放置10－15min，待血小板完全下沉后，先將中央大方格移至低倍鏡視野內(nèi)，再轉(zhuǎn)以高倍鏡，數(shù)5個中方格內(nèi)的血小板數(shù)。
4．血小板大小形態(tài)不一致，但均呈折光的發(fā)亮淡藍(lán)色小點，大小約紅細(xì)胞的1／7—1／2，呈不規(guī)則圓形或長圓形。在計數(shù)時必須來回扭動顯微鏡微調(diào)，不要遺漏計數(shù)。
5．計算：5個中方格血小板總和×1／50mm3(5個中方格的體積)×1／20(稀釋倍數(shù))=1／1 000mm3。
故5個中方格的總和×1 000=l mm3血液的血小板數(shù)。
（二）血小板稀釋液的配置
1．配方一：尿素稀釋液：
尿素 1.3g
枸櫞酸鈉 0.5g
甲醛 0.1ml
蒸餾水加至 100ml
將尿素、枸櫞酸鈉溶于蒸餾水中，然后加入甲醛。為方便觀察，可加入少許美藍(lán)，放冰箱保存，用前必須過濾。
2．配方二：1％草酸銨稀釋液：
草酸銨 1g
蒸餾水加至 100ml

六．網(wǎng)織紅細(xì)胞計數(shù)

（一）計數(shù)方法
1．在小試管中滴加1滴煌焦油藍(lán)生理鹽水溶液，再加入末稍血 2滴，充分混合均勻。
2．靜置15～20分鐘后，取1滴制成薄片。
3．油鏡下檢查1000個紅細(xì)胞中的網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)，以百分率表示。
網(wǎng)織紅細(xì)胞**值計算：網(wǎng)織紅細(xì)胞數(shù)／µ1＝（網(wǎng)織紅細(xì)胞％×紅細(xì)胞數(shù)／µ1）/100
（二）煌焦油藍(lán)生理鹽水溶液配制：
煌焦白藍(lán) 1g
枸櫞酸鈉 0.4g
氯化鈉 0.85g
蒸餾水加至 100ml
過濾后備用

七．骨髓細(xì)胞計數(shù)：

將小鼠頸椎脫位處死，取l根股骨，用10ml 3％醋酸溶液沖出骨髓細(xì)胞，在血細(xì)胞計數(shù)器上計數(shù)4個大方格的細(xì)胞數(shù)，所得細(xì)胞數(shù)乘以2．5 x 100 000，即為1根股骨中骨髓有核細(xì)胞數(shù)。2.5 × 100 000表示稀釋倍數(shù)。 4個大方格的體積為0.4mm3，而1000mm3＝l mL，現(xiàn)稀釋成10mL，所以乘2.5 × 100 000。

八．紅細(xì)胞比積及紅細(xì)胞沉降率的測定

（一）紅細(xì)胞比積的測定
1．溫氏管法：靜脈采血2ml，注入抗凝管中，充分混勻，再用細(xì)長毛細(xì)滴管吸取混勻的抗凝血，插入紅細(xì)胞比積管底部，然后將血液緩慢注入至刻度“10”處，水平離心機(jī)以3000rpm離心30分鐘，讀取紅細(xì)胞層柱高的毫米數(shù)。再離心10分鐘，至紅細(xì)胞不再下降為止，乘以0.01，即為每升血液中紅細(xì)胞體積（L/L）。
2．毛細(xì)管法：使用虹吸法取外周血充進(jìn)毛細(xì)管內(nèi)，把毛細(xì)管的一端插入橡皮泥中，封口，高速離心機(jī)12000rpm 5分鐘，測量血液總長度和紅細(xì)胞長度，計算紅細(xì)胞所占百分率。即為紅細(xì)胞比積。
（二）紅細(xì)胞沉降率的測定
取直徑為3mm的試管1支，加入抗凝劑0.4m1，常規(guī)靜脈采血后，將血加入試管至2ml，混勻，用血沉管吸取上述混勻血液至“0”刻度處。將管直立在血沉架上，室溫靜置l小時。觀察血漿高度，紅細(xì)胞下沉的毫米數(shù)即為結(jié)果。
在測定紅細(xì)胞沉降率時應(yīng)注意：標(biāo)本采集時要避免脂肪血；血液和抗凝劑比例要準(zhǔn)確；放置要垂直；做血沉的標(biāo)本要在采集后3h內(nèi)測定，并充分混勻；血沉應(yīng)在18～25℃室內(nèi)測定。