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技術(shù)文章

酶切體系的建立

酶 切 反 應(yīng)
(Setting Up a Restriction EndonucleaseReaction)

一、 建立一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的酶切反應(yīng)
　目前大多數(shù)研究者遵循一條規(guī)則，即10個(gè)單位的內(nèi)切酶可以切割1μg不同來(lái)源和純度的DNA。通常，一個(gè)50μl的反應(yīng)體系中，1μl的酶在1XNEBuffer終濃度及相應(yīng)溫度條件下反應(yīng)1小時(shí)即可降解1μg已純化好的DNA。如果加入更多的酶，則可相應(yīng)縮短反應(yīng)時(shí)間；如果減少酶的用量，對(duì)許多酶來(lái)說(shuō)，相應(yīng)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間（不超過(guò)16小時(shí)）也可完全反應(yīng)。

二、 選擇正確的酶
　不言而喻，選擇的酶在底物DNA上必須至少有一個(gè)相應(yīng)的識(shí)別位點(diǎn)。識(shí)別堿基數(shù)目少的酶比堿基數(shù)目多的酶更頻繁地切割底物。假設(shè)一個(gè)GC含量50%的DNA鏈，一個(gè)識(shí)別4個(gè)堿基的酶將平均在每44（256）個(gè)堿基中切割一次；而一個(gè)識(shí)別6個(gè)堿基的酶將平均在每46（4096）堿基切割一次。內(nèi)切酶的產(chǎn)物可以是粘端的（3'或5'突出端），也可以是平端的片段。粘端產(chǎn)物可以與相容的其它內(nèi)切酶產(chǎn)物連接，而所有的平端產(chǎn)物都可以互相連接。相關(guān)信息參見(jiàn)目錄的CompatibleCohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。

三、 酶
　內(nèi)切酶一旦拿出冰箱后應(yīng)當(dāng)立即置于冰上。酶應(yīng)當(dāng)是*后一個(gè)被加入到反應(yīng)體系中（在加入酶之前所有的其它反應(yīng)物都應(yīng)當(dāng)已經(jīng)加好并已預(yù)混合）。酶的用量視在底物上的切割頻率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超過(guò)1U/μg的酶才能被完全切割。參見(jiàn)目錄第244和264之"切割質(zhì)粒DNA"和"包埋法切割DNA"。

四、 DNA
　待切割的DNA應(yīng)當(dāng)已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污劑或過(guò)多鹽離子的污染，以免干擾酶的活性。DNA的甲基化也應(yīng)該是酶切要考慮到的因素。關(guān)于甲基化的內(nèi)容，參見(jiàn)第252頁(yè)至253頁(yè)之甲基化相關(guān)內(nèi)容。

五、 緩沖液
　對(duì)于每一種酶NEB都提供相應(yīng)的*佳緩沖液，可保證幾乎100%的酶活性。使用時(shí)的緩沖液濃度應(yīng)為1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)*佳活性。在這種情況下，我們也相應(yīng)提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會(huì)受太大影響。關(guān)于緩沖液更詳細(xì)的信息參見(jiàn)第234頁(yè)。

六、 反應(yīng)體積
　內(nèi)切酶活力單位的定義是：1小時(shí)內(nèi)，50μl反應(yīng)體積中，降解1μg的底物DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。因此酶：DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度??制在5%以下，要注意酶的體積不要超過(guò)總體積的10%（一般酶都貯存于50%的甘油中）。

七、 混合
　這是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反應(yīng)完全，必須使反應(yīng)液充分混合。我們推薦用槍反復(fù)吸取混合，或是用手指輕彈管壁混合，然后再快速離心一下即可。注意：不可振蕩！

八、 反應(yīng)溫度
　大部分酶的反應(yīng)溫度為37°C；從嗜熱菌中分離出來(lái)的內(nèi)切酶則要求更高的溫度。一般為50-65°C不等。參看第244頁(yè) Activityof thermophiles at 37°C。

九、 反應(yīng)時(shí)間
　1酶活單位的定義時(shí)間為1小時(shí)。如果加入的酶較多，可以相應(yīng)地縮短反應(yīng)時(shí)間；反之，如果加入的酶量較少，也可以延長(zhǎng)時(shí)間以使反應(yīng)達(dá)到完全。參見(jiàn)第241頁(yè)酶在反應(yīng)中的存活時(shí)間。

十、 終止反應(yīng)
　如果不進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用終止液來(lái)終止反應(yīng)。在NEB我們使用如下反應(yīng)終止液：50%的甘油，50mMEDTA（pH8.0），和0.05%溴酚藍(lán)（10μl/50μl反應(yīng)液）。如果要進(jìn)行下一步酶切反應(yīng)，可用熱失活法終止反應(yīng)（65°C或85°C，20分鐘）。熱失活并不能適用于所有的酶，詳情參見(jiàn)第240頁(yè)熱失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于終止反應(yīng)。

十一、貯存
　大部分酶應(yīng)貯存于-20°C。少部分酶則須在-70°C長(zhǎng)期保存。詳情請(qǐng)參見(jiàn)相關(guān)酶的DATA SHEET 或目錄相關(guān)部分。10XBUFFER 和100X BSA于-20°C保存。BSA不能與NEBuffer混合后保存，否則將會(huì)出現(xiàn)BSA沉淀。

十二、穩(wěn)定性
　每隔1-2個(gè)月都會(huì)對(duì)所有的酶有一個(gè)活性檢測(cè)；*近的一次檢測(cè)結(jié)果將被貼在售出的每一管酶上。通過(guò)三十多年來(lái)的經(jīng)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)大部分酶在推薦的保存緩沖液里在-20°C條件下十分穩(wěn)定。高于-20°C條件下穩(wěn)定性將有所降低。

十三、對(duì)照反應(yīng)
　如果發(fā)現(xiàn)您的DNA底物不能被成功切開(kāi)，可以進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)以查明原因。具體方法如下：
　將不加內(nèi)切酶的底物DNA（待切底物）與加入了內(nèi)切酶的對(duì)照DNA（有多個(gè)已知酶切位點(diǎn)）同時(shí)進(jìn)行反應(yīng)。若實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明底物DNA降解，則說(shuō)明DNA在純化過(guò)程中或反應(yīng)液里引入了核酸酶污染；若實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)底物DNA保持完整，而對(duì)照DNA被成功切開(kāi)，則可以排除酶質(zhì)量的原因，此時(shí)可以將對(duì)照DNA和待切底物DNA混合起來(lái)再次進(jìn)行反應(yīng)，以確定樣品中是否有抑制劑。如果有抑制劑存在（通常是鹽、EDTA或酚），則混合物里的對(duì)照DNA也無(wú)法被切開(kāi)。