小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒使用說明

(產(chǎn)品貨號(hào)：FS5300)

原理

本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心 ELISA法。用抗小鼠Ig多抗包被于酶標(biāo)板上，樣品中的 Ig與多抗結(jié)合，加入分別針對(duì)小鼠 IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA，IgM，kappa light chain，lambda light chain 的特異性抗體，形成**復(fù)合物連接在板上，加入酶底物TMB，出現(xiàn)藍(lán)色，加終止液硫酸，顏色變黃，在450nm處測(cè)OD值，Ig濃度與OD值成正比，可通過顏色鑒定出標(biāo)本中Ig亞型。

試劑盒組成（2-8℃保存）

準(zhǔn)備試劑與收集血樣

1. 10×標(biāo)本稀釋液用蒸餾水作1:10倍稀釋（示例：1ml濃稀釋液+9ml蒸餾水）。
2. 雜交瘤細(xì)胞上清 : 將樣本以 1× PBST 1:100 稀釋，例如 10 uL 雜交瘤細(xì)胞上清 + 990 uL 1×PBST。推薦稀釋范圍為 1:20-1:200。
3. 腹水 : 將樣本以 1×PBST 1:100000 稀釋，例如 1 uL 腹水 + 1 mL 1×PBST（1:1000），再取上述混合液 5 uL + 495 uL 1× PBST。推薦稀釋范圍為 1:50000-1:200000。
4. 純化抗體 : 將樣本以1×PBST 稀釋至 200 ng/mL，推薦稀釋濃度為 20 ng/mL-1 ug/mL。
5. 洗滌液：用重蒸水1:20稀釋（示例：1ml濃縮洗滌液加入19ml的重蒸水）

檢測(cè)程序

1. 加樣：每孔各加入待測(cè)樣品100ul，將反應(yīng)板充分混勻后置37℃30分鐘。
2. 洗板：用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4-6次，向?yàn)V紙上印干。。
3. 每孔加酶標(biāo)抗體工作液100ul。將反應(yīng)板置37℃30分鐘。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗處反應(yīng)15分鐘。
6. 每孔加入100ul終止液混勻。
7. 30分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)吸光值。

結(jié)果計(jì)算與判斷

1. 結(jié)果判讀。結(jié)果可以對(duì)照下圖以肉眼判定，也可以通過酶標(biāo)儀讀取 OD450。顏色*深或是 OD 值*高孔對(duì)應(yīng)的即為相應(yīng)亞型。

試劑盒性能

            1. 靈敏度：*小的Ig 檢測(cè)濃度小于6ng/ml。

2. 特異性：可同時(shí)檢測(cè)重組或天然的小鼠Ig。不與小鼠其它細(xì)胞因子有交叉反應(yīng)。
3. 重復(fù)性：板內(nèi)、板見變異系數(shù)均小于10％。

注意事項(xiàng)

            1. 以上標(biāo)準(zhǔn)孔及待測(cè)樣品均建議做復(fù)孔，每次測(cè)定應(yīng)同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2. 洗滌過程很關(guān)鍵。洗滌不充分將導(dǎo)致**度誤差及OD值錯(cuò)誤地升高。

            3. 檢測(cè)時(shí)所有試劑都要恢復(fù)到室溫。板條開封后剩余板條要再封好，保持板條干燥。

            4. 試劑盒使用超敏TMB溶液，若顯色過深會(huì)出現(xiàn)絮狀物，屬正?，F(xiàn)象，不影響結(jié)果判讀。

            5. 說明書中試劑盒組成為96T的量，48T的量應(yīng)減半！

6. 本試劑盒宜置4oC冰箱保存。僅用于科研，不能用于臨床診斷！