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楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

一、實驗?zāi)康?/span>

1、觀察D-半乳糖所致的小鼠老年癡呆的癥狀及探討楓荷桂提取物、他克林的療效的比較。

2、測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力是否有所變化，同時測定其血液的SOD（超氧化酶歧化酶）活性及大腦勻漿膽堿酯酶的活性，并做海馬區(qū)的老年斑測定。

二、實驗原理

1、D-半乳糖腹腔注射可模擬AD氧化損傷，導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶下降、腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)功能衰退、神經(jīng)遞質(zhì)代謝異常、皮層和海馬神經(jīng)元損傷、超微結(jié)構(gòu)和突觸可塑性發(fā)生衰退性改變及Aβ淀粉樣蛋白的沉積，病變與AD病變類似，可用于誘導(dǎo)建立AD模型鼠。

2、SOD（超氧化物歧化酶）是一種源于生命體的活性物質(zhì)，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。對人體不斷地補充 SOD具有抗衰老的特殊效果，Aβ淀粉樣蛋白的沉積會對大腦產(chǎn)生**作用，引起血液中SOD的改變。鄰苯三酚自氧化法：即改良Marklund法。原理是基于經(jīng)典的分光光度法，在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化成紅桔酚，用紫外-可見光譜跟蹤波長為325nm、420nm或650nm(經(jīng)典為420nm)，同時產(chǎn)生O2 ，SOD催化O2 發(fā)生歧化反應(yīng)從而抑制鄰苯三酚的自氧化，樣品對鄰苯三酚自氧化速率的抑制率，可反映樣品中的SOD含量

3、血液膽堿酯酶使乙酰膽堿分解為膽堿和乙酸。未被膽堿酯酶水解而剩余的乙酰膽堿與堿性羥胺反應(yīng)，生成乙酰羥胺，然后乙酰羥胺與三氯化鐵在酸性溶液中反應(yīng)，形成紅色羥肟酸鐵絡(luò)合物，顏色深度與剩余乙酰膽堿的量成正比。在520nm波長比色定量，由水解的乙酰膽堿的量計算膽堿酯酶活性。

4、Morris水迷宮測定小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，雖然老鼠是天生的游泳健將，但是它們卻厭惡處于水中的狀態(tài)，同時游泳對于老鼠來說是十分消耗體力的活動，他們會本能的尋找水中的休息場所。尋找休息場所的行為涉及到一個復(fù)雜的記憶過程，包括收集與空間定位有關(guān)的視覺信息，再對這些信息進行處理、整理、記憶、加固、然后再取出，目的是能成功的航行并且找到隱藏在水中的站臺，*終從水中逃脫。通過水迷宮視頻分析系統(tǒng)能得到小鼠空間記憶的相關(guān)數(shù)據(jù)。

5、避暗法，穿梭箱為長方形盒（50cm×23cm×30cm），用一帶門（7cm×5cm）隔板分成**區(qū)和電擊區(qū)，電擊區(qū)底部為可通電的銅柵欄（間隔0.5 cm），頂部有一聲源，實驗分為訓(xùn)練和正式測試兩部分，挑選對電擊反應(yīng)較為一致的小鼠進行訓(xùn)練，將小鼠放入穿梭箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境1min，然后置于電擊區(qū)，以聲音為條件刺激，響10s后，以電擊（40V）為非條件刺激，使小鼠逃向**區(qū)。訓(xùn)練期4d，每天10次，每次間隔2-3 min.d5進行正式測試，觀察10次反應(yīng)，在聲音10s內(nèi)進入暗室為主動回避反應(yīng)陽性，記錄從聲音到小鼠進入暗室的時間（主動回避），10s內(nèi)不主動回避，給以電擊后進入暗室為被動逃避，記錄被動逃避次數(shù)。通過此裝置能得到小鼠受刺激記憶的數(shù)據(jù)。

6、AD主要表現(xiàn)為認知和記憶障礙，而認知和記憶障礙的主要解剖基礎(chǔ)為海馬組織結(jié)構(gòu)的萎縮及病變，功能基礎(chǔ)主要為膽堿能神經(jīng)興奮傳遞障礙和**神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)乙酰膽堿受體變性。膽堿酯酶抑制劑（如他克林）能改善**膽堿能神經(jīng)功能。

6、阿爾茨海默(AD)的主要病理學(xué)特征是海馬和皮層出現(xiàn)大量的細胞外老年斑(SP)。生化研究表明,SP的主要成分為-淀粉樣蛋白(AP),它與AD的病理形成過程關(guān)系密切。老年斑為細胞外結(jié)構(gòu)，直徑為20~150μm，多見于內(nèi)嗅區(qū)皮質(zhì)，海馬CA-1區(qū)，其次為額葉和顳葉皮質(zhì)。其中心為淀粉樣蛋白，周圍由剛果紅染色染成紅色。

三、老年癡呆癥狀

   老年癡呆又稱爾茨默病 （lzheimer' disease, D)是發(fā)生在老年期及老年前期的一種原發(fā)性退行性腦病，指的是一種持續(xù)性**神經(jīng)功能活動障礙，即在沒有意識障礙的狀態(tài)下，記憶、思維、分析判斷、視空間辨認、情緒等方面的障礙。其特征性病理變化為大腦皮層萎縮，并伴有β-淀粉樣蛋白(β-amyloid,β-AP)沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillarytangles,NFT)，大量記憶性神經(jīng)元數(shù)目減少，以及老年斑(senileplaque, P)的形成

四、**的療效作用

1、他克林為膽堿酯酶抑制劑，能抑制血漿中的AchE,又可抑制組織中的AchE。能改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，且能有效的減少大腦老年斑的數(shù)量，以能提高血漿中SOD及乙酰膽堿的的活性。

2、楓荷桂的藥效有實驗結(jié)果數(shù)據(jù)分析得。楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

五、實驗材料

1、器材：鼠籠，注射器，試管，容量瓶，灌胃器，恒溫水浴鍋，紫外分光光度計，液體快速混合器，水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)，小鼠避暗儀，離心機，切片機，勻漿器。

2、藥品：D-半乳糖，吡拉西坦，楓荷桂提取液

3、試劑：苦味酸; 三羥甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二鈉、雙蒸水、HCl、鄰苯三酚; 酒精、冰醋酸、蘇木精、甘油、鉀礬（硫酸鋁鉀）、伊紅、剛果紅、甲醇、蛋白、水楊酸鈉（防腐劑）、****鈉、生理鹽水、多聚甲醛、乙醇、二甲苯、氫氧化鉀、樹膠、石蠟 ; 磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，鹽酸羥胺，氫氧化鈉，濃鹽酸，三氯化鐵，蒸餾水，乙酰膽堿，草酸鉀。

4、動物:昆明品系健康小白鼠48只

六、實驗方法

實驗前準備

1、分組

小鼠48只，體重18~22g，雌雄各半，隨機分為空白對照組、模型組、楓荷桂提取物組、他可林組四個組，每組12只，對每組和每只小白鼠做好標記。實驗前，將所有實驗用的小白鼠在實驗室內(nèi)飼養(yǎng)1周，使其熟悉實驗環(huán)境，自由飲水和取食， 飼養(yǎng)條件安靜和較暗，室溫20～25℃。

2、給藥

①對照組灌胃生理鹽水0.25lm/d，模型組、楓荷桂提取物組、他可林組均每日腹腔注射120mg/kgD-半乳糖，楓荷桂組每日按10g/kg灌胃，他可林組每日按3g/kg灌胃，進行30天，每3天測定一次小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，每天每只測2次??

②D-半乳糖注射液：可以網(wǎng)購的吧

楓荷桂：30g提取物溶于水中，定容到75ml得灌胃液。

  他可林：藥店應(yīng)該有得賣。楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

③藥品總量：

楓荷桂提取物：10g/kg×（0.02kg×10只）×30天=60g

他克林：3g/kg×（0.02kg×10只）×30天=18g

D-半乳糖：120mg/kg×（0.02kg×10只）×3組×30天=72g

3、取樣

①血液及腦勻漿：每組取5只，小鼠禁食12h，斷頭處死，取血，之后取全腦(嗅腦除外)，置勻漿器中，加入預(yù)冷生理鹽水制成10g／m1腦勻漿，3000r／min離心10min，取上清液置冰浴中，按部分測定方案測腦勻漿AchE、血液SOD活性。

②腦切片組織：，每組余下小鼠動物經(jīng)1%****鈉腹腔麻醉,剪開胸廓,經(jīng)心尖插管至主動脈根部,先用生理鹽水快速灌注沖洗,隨后灌入固定液4%多聚甲醛,開顱取腦，置4%的甲醛溶液中固定24h。按石蠟包埋切片方法制備切片。

實驗步驟

一、建模

   Morris水迷宮試驗

1、大鼠在造模前均進行水迷宮游泳訓(xùn)練，訓(xùn)練至整個游泳從起始到找到平臺所需時間連續(xù)3次都小于10s為獲得記憶。

2、實驗組小鼠每日按120mg/kg空腹腹腔注射D-半乳糖，連續(xù)注射4周。對照組注射等量生理鹽水。

3、注射3周后對動物進行Morris水迷宮測試，在同一時間上再重新進行水迷宮游泳實驗，小鼠尋找并爬上平臺所需要的時間為逃避潛伏期，共3次，計算平均成績。

注意：水迷宮實驗環(huán)境要求安靜，避免外界干擾，室內(nèi)日光燈照明，水溫25℃，一般時間選擇在13：00—17：00，19：00—21：00。

避暗實驗

正式實驗前對各組小鼠進行訓(xùn)練，將小鼠頭背著洞口放入明室，先適應(yīng)環(huán)境3min，然后給暗室銅柵通36V電流，小鼠進入暗室后受到電擊即逃到明室，銅柵持續(xù)通電5min，此為訓(xùn)練過程。24h后進行小鼠的記憶測驗，記錄小鼠**次進入暗室的時間（避暗潛伏期），若小鼠5min內(nèi)仍未進入暗室，其潛伏期計作300s。

二、采血測定SOD及膽堿酯酶含量

腹腔注射D-半乳糖之前對小鼠進行一次采血測定SOD及膽堿酯酶含量，作為空白對照。建模成功后，進行正常采血。

                   SOD含量的測定

1、鄰苯三酚自氧化速率的測定

取兩支試管按下表加入25℃預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的鄰苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長處測定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.07（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。

2、SOD樣液的活性測定

樣品管取代自氧化管。樣品管測定時先加入預(yù)熱的待測酶液，再加鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測定。

3計算

                 膽堿酯酶的測定

1、試劑配制

①磷酸鹽緩沖液（PH=4.5）：準確稱取4.156g磷酸氫二鈉和1.3617g磷酸二氫鉀，用水溶解并稀釋到500ml，保存冰箱內(nèi)??

②堿性羥胺溶液：臨用前將139g∕L鹽酸羥胺溶液和140g∕L氫氧化鈉溶液等體積混合。

③4mol∕L鹽酸溶液：量取比重1.19的濃鹽酸100ml，加蒸餾水至300ml。

④10%三氯化鐵溶液：10g三氯化鐵，加蒸餾水10ml，濃鹽酸0.84ml，加蒸餾水至100ml，存于棕色瓶中備用。

⑤乙酰膽堿標準液：**稱取乙酰膽堿1.，用磷酸緩沖液（PH=4.5）溶解，并稀釋到100ml，此溶液1ml相當于70umol乙酰膽堿，為貯備液。臨用前，取此溶液用磷酸鹽緩沖液（PH=4.5）稀釋10倍，此時溶液1ml相當于7umol乙酰膽堿，為應(yīng)用液。2716g

⑥草酸鉀抗凝劑：取草酸鉀10g，加蒸餾水少許使溶解，再加蒸餾水至100ml。配制成10％水溶液，如每管加0.1ml則可使5~10ml血不凝。一般如作微量檢驗，用血量較少，可配制成2％溶液，如每管加0．1ml可使1~2ml血液不凝。

按照師姐的測定方法測定。

三、石蠟切片制備及老年斑染色

實驗程序：

1、取材

采血測試完畢后,次日動物經(jīng)1%****鈉腹腔麻醉,剪開胸廓,經(jīng)心尖插管至主動脈根部,先用生理鹽水快速灌注沖洗,隨后灌入固定液4%多聚甲醛,開顱取腦，置4%的甲醛溶液中固定24h。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以5mm×5mm×2mm或10 mm×10 mm×2 mm為宜。取下所需要的腦組織，切成一小塊2~3mm厚。楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

取材的注意事項：

（1）取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。

（2）切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。

2、固定

將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定30~50min。

固定的注意事項：

（1）一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化學(xué)變化，失去固定作用。

（2）有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。

（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的20~30倍，有些水分多的材料，中間應(yīng)更換1~2次新液。

（4）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材料在溶液中投入相應(yīng)的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。

3、 洗滌

材料經(jīng)固定后，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。因為殘留在組織中的固定液，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察。沖洗方法根據(jù)固定液的性質(zhì)而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%~70%乙醇沖洗。

4、 脫水

30%、50%、70%、80%、90%各級乙醇溶液脫水各40min，放入95%、100%各兩次，每次20min。各種材料經(jīng)固定與洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去。

脫水注意事項：

（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。

（2）在更換高**的脫水劑時，*好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿內(nèi)剩余液，然后于皿中加入高**脫水劑。

（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。

（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。

（5）如需過夜，應(yīng)停留在70%酒精中。

（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑內(nèi)出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象

5、透明

純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h（或至透明為止），須換一次二甲苯。

由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。

透明注意事項

（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。

（2）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕氣。

（3）在透明過程中， 如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。

6、透蠟

放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟Ⅰ、石蠟Ⅱ透蠟各20~30分鐘。

透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織的透蠟時間較長，約需1~2d。透蠟應(yīng)在恒溫箱內(nèi)進行，并保持箱內(nèi)溫度在55~60℃左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。置于恒溫箱0.5h。

透蠟注意事項

（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；

（2）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；

（3）操作要迅速，力求在*短的時間內(nèi)完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮等。

7、 包埋

將經(jīng)過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器內(nèi)，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。

用于包埋的石蠟的熔點在50~60℃之間，包埋時應(yīng)根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因素，選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為52~56℃，植物材料用的石蠟熔點為54~58℃。

包埋的操作過程楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min）后即可取出備用。

8、 切片

①將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。

②將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。

③搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口。

④調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。

⑤調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為4~10微米。

⑥一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以40~50r/min。

⑦切成的蠟帶到20~30cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。

⑧用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴，置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。

⑨切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。

9、 貼片

①、取一片清潔的載玻片，滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成

均勻薄層。楓荷桂對D-半乳糖所致老年癡呆癥狀的療效研究

②、滴1~2滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。

③、用小鑷子夾取預(yù)先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。

④、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展。或放置置于預(yù)先加熱的展片臺上（溫度保持在40~45℃）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。

⑤、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37℃溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。

10、脫蠟復(fù)水

石蠟切片經(jīng)二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟各5~10min，然后放入100%、95%、90%、80%、70%等各級酒精溶液中各3~5min，再放入蒸餾水中3min。

染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復(fù)水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。

11、染色

①剛果紅染色：SP老年斑一般用剛果紅染色，也可以用硝酸銀染色。老年斑的染色方法是：Highman甲醇剛果紅染色法。
1.甲醇剛果紅染液: 剛果紅 0.5 g 甲醇 80 ml 甘油 20 ml
2.堿性乙醇分化液: 氫氧化鉀 0.2 g 80%乙醇 100 ml
染色步驟:1. 切片脫蠟至水2. 甲醇剛果紅染液染10～20分鐘3. 用堿性乙醇分化液分化數(shù)秒4. 水洗5. 蘇木素復(fù)染2分鐘6. 水洗. 脫水,透明,封固7結(jié)果：淀粉樣物呈桔紅色

②H.E.對染法：

1、切片放入蘇木精中染色約10~30min。染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色，染色時間可短些，否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放入恒溫箱中染色。

2、水洗

用自來水流水沖洗約15min。沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍（或放入堿性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應(yīng)以流水沖洗使切片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。

3、分化

就是將細胞質(zhì)著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關(guān)鍵，，如分化不當會導(dǎo)致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色效果差。如果染色適中，可取消此步驟。

4、漂洗

切片再放入自來水流水中使其恢復(fù)藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結(jié)構(gòu)清楚；細胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標準。然后放入蒸餾水中漂洗一次。

5、脫水Ⅰ

切片入50%乙醇→70%乙醇→80%乙醇中各3~5min。

6、復(fù)染

用0.5%伊紅乙醇液對比染色2~5min。伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與蘇木精染細胞

核的濃淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。

7、脫水Ⅱ：

放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中3~5min。*后用吸水紙吸干多余的乙醇。

12、透明

切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約5min，然后放入純二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各3~5min。二甲苯應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸內(nèi)吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。

13、封藏：中性樹膠封存

切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是**保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑，樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。

封藏的方法：

封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，按照下列方法進行封藏。在桌上放一張潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。

染色結(jié)果：細胞核被蘇木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。

四、統(tǒng)計分析：所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)和標準差表示，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行組間t檢測和單因素方差分析比較組間差異，p＜0.05為差異具有顯著性，p＜0.01為具有非常顯著的差異。

4、經(jīng)費預(yù)算

①雌雄各半，小白鼠一只7元，48只就338元。路費一去一回（火車45+汽車65）110元。

②測AchE總需         ，測SOD總需，切片部分總需（有蠻多藥品查不到價格，沒有得出預(yù)算。）