流式細胞儀(FCM)是八十年代集單克隆抗體、熒光化學(xué)、激光、計算機等高技術(shù)發(fā)展起來的一種先進儀器，已廣泛應(yīng)用于**學(xué)、生物化學(xué)、生物學(xué)、腫瘤學(xué)以及血液學(xué)等方面的研究和臨床常規(guī)工作。其中檢測人白細胞表面標(biāo)志可對白血病、**瘤作用迅速正確的診斷，對**細胞群和亞群進行**分類，還能分離純化某一群或亞群細胞?；罴毎?*熒光技術(shù)是用于FCM檢測的標(biāo)本準(zhǔn)備，染色后也能在熒光顯微鏡下進行觀察，在某些實驗條件下，活細胞**熒光染色后的特異性和敏感性要優(yōu)于滴片固定的常規(guī)間接**熒光的結(jié)果。

(一)  原理

   活細胞表面保留有較完整的抗原或受體，先用特異性鼠源性單克隆抗體與細胞表面相應(yīng)抗原結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的**抗體結(jié)合，根據(jù)所測定的熒光強度和陽性百分率即可知相應(yīng)抗原的密度和分布。 

(二)  操作步驟    

 制備活性高的細胞懸液(培養(yǎng)細胞系、外周血單個核細胞、   

 胸腺細胞、脾細胞等均可用于本法)                

   ↓        

         用10％FCS RPMI1640調(diào)整細胞濃度為      

5×10６～１×10７／ml            

              ↓       

     取40μl細胞懸液加入預(yù)先有特異性McAb(5～50μl)      

     的小玻璃管或塑料離心管，再加50μl 1∶20(用DPBS      

   稀釋)滅活正常兔血清                 

 ↓4℃ 30min     

用洗滌液洗滌2次，每次加洗滌液2ml左右           

            1000rpm×5min              

        ↓         

         棄上清，加入50μl工作濃度的羊抗鼠       

(或兔抗鼠)熒光標(biāo)記物，充分振搖                

     ↓ 4℃ 30min      

       用洗滌液洗滌2次，每次加液2ml左右        

               1000rpm×5min          

                    ↓     

       加適量固定液(如為FCM制備標(biāo)本，一般加入       

 1ml固定液，如制片后在熒光顯微鏡下觀察，   

 視細胞濃度加入100～500μl固定液)              

            ↓         

 FCM檢測或制片后熒光顯微鏡下觀察      

     (標(biāo)本在試管中可保存5～7天)   

(三)    試劑和器材  

1.    各種特異性單克隆抗體。 

2.    熒光標(biāo)記的羊抗鼠或兔抗鼠**抗體，滅活正常兔血清。

3.    10％ FCS RPMI1640, DPBS、洗滌液、固定液(見附錄)。 

4.    玻璃管、塑料管、離心機、熒光顯微鏡等。

(四)    注意事項  

1.    整個操作在4℃下進行，洗滌液中加有比常規(guī)防腐劑量高10倍的NaN３，上述實驗條件是防止一抗結(jié)合細胞膜抗原后發(fā)生交聯(lián)、脫落。  

2.    洗滌要充分，紅外碳硫儀以避免游離抗體封閉二抗與細胞膜上一抗相結(jié)合，出現(xiàn)假陰性。

3.    加適量正常兔血清可封閉某些細胞表面**球蛋白Fc受體，降低和防止非特異性染色。  

4.    細胞活性要好，否則易發(fā)生非特異性熒光染色。 

 附:    1. DPBS (×10, 貯存液)  

   NaCl 80g   

 KCl 2g      蒸餾水加至1000ml   

 Na２HPO４ 11.5g 臨用時用蒸餾水1∶10稀釋    

 KH２PO４ 2g 

2. 洗滌液   

 DPBS      900ml   

 FCS 50ml (終濃度 5％)   

 4％NaN３   50ml (終濃度0.2％) 

 3. 固定液   

  DPBS    1000ml   

葡萄糖    20g (終濃度2％) 

  甲 醛    10ml   

   NaN３   0.2g (終濃度0.02％

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